德國蘋果病毒病分子檢測與防控技術考察報告

李元軍 周先學 趙玲玲 蘇佳明 唐美玲

山東省煙臺市農業科學研究院·265500

為執行國家外國專家局出國培訓項目CG2011370012“蘋果病毒病的分子檢測與防控利用”，由山東省煙臺市農業科學研究院5名科技人員組成的培訓團于 2011年8月20日至9月9日赴德國栽培作物聯邦研究中心(JKI）果樹及葡萄栽培植物保護研究所進行了為期21 d的技術培訓，期間考察了解了德國關于蘋果病毒病、蘋果植原體病害的研究新進展，學習了蘋果莖痘病毒、蘋果花葉病毒和蘋果褪綠葉斑病毒的分子檢測技術，特別是帶病毒樣品處理、RNA提取、反轉錄PCR及凝膠成像等關鍵檢測技術與方法；還參觀了該所的果樹病毒純種保存圃與溫室，實地學習、觀察了多種蘋果病毒病在蘋果樹上的表現癥狀以及病毒傳播途徑。另外，還與研究所的果樹昆蟲學、植原體學、真菌學和細菌學等方面專家以及部分地區生產部門的技術人員進行了座談，初步了解與學習了德國蘋果病毒病的檢測與防控技術，以及果樹生產與科研現狀，現將有關情況總結匯報如下。

1 研究所概況

JKI，位于德國海德堡市道森漢姆鎮。其主要任務是開展農作物植物保護、產品評估、果樹與葡萄的病蟲害和有害生物傳播途徑、植物保護防控技術措施、抗病性優良新品種選育等方面的研究以及果樹病蟲害的預測預報與預警機制的建立。

該所共有9個研究室，主要從事果樹細菌學、真菌學、植原體、病毒等果樹植物保護及葡萄栽培研究。其中果樹植物保護研究方面有6個研究室，分別是果樹細菌學與火疫病研究室、化學生態學與植物病理學研究室、果樹昆蟲學研究室、果樹真菌學研究室、果樹植原體研究室、果樹病毒與類病毒研究室；葡萄栽培研究方面有3個研究室，分別是葡萄真菌研究室、葡萄流行病載體研究室、葡萄昆蟲研究室；以及1個國際學員培訓中心（大學聯合）和2個試驗農場。現有主要課題項目負責人14位。近10年來，先后承擔歐盟、聯邦政府和地方項目55項。在《病蟲害科學》《細菌學》《化學生態學》《作物學報》《植物病理學》《園藝學文摘》等國際知名刊物發表論文260余篇。

JKI是聯邦政府在奎德林堡建立的一個國家級權威的獨立研究機構。JKI目前擁有1200名科研人員，其中包括300名科學家，在柏林 (Berlin and kleinmachnow)、 奎德林堡（Quedlinburg）、不倫瑞克(Braunschweig)和道森海姆(Dossenheim)等地共有15個研究所，以及信息中心、圖書館等機構。JKI致力于研究植物遺傳、作物栽培、植物營養、土壤科學、植物保護和植物檢疫等栽培植物生物學的廣泛領域，這使得JKI在作物種植產業中起到了至關重要的作用。

果樹及葡萄栽培植物保護研究所隸屬于

2 蘋果病毒病和植原體病害研究

2.1 病毒病研究 早在19世紀50年代，德國已開始進行對蘋果病毒種類的調查鑒定工作。到目前為止，德國已報道的蘋果病毒及其類似病原物有30多種。主要包括蘋果花葉病毒(APMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、蘋果莖痘病毒(ASPV)和蘋果莖溝病毒(ASGV)。關于蘋果病毒病的檢測，由于指示植物法所需檢測時間長，而酶聯免疫法存在假陽性率高等缺點，目前德國主要應用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術。該方法敏感性和特異性都大大增強，并且很適合大量樣品的快速檢測。此外他們還發展了多重RT-PCR，實現了在一個反應體系中不但可以對一種類病毒核酸進行擴增，而且可以同時對多種類病毒核酸片段進行擴增，此法在檢測果樹病毒復合侵染時很有效，且省時省力。利用RT-PCR方法檢測和鑒定果樹病毒，最重要的一個步驟是RNA的提取。關于植物總RNA的提取，最常用的方法是CTAB法和二氧化硅吸附法。目前在德國最常用的方法是二氧化硅吸附法，與CTAB法相比，該方法操作簡單，RNA穩定性好，常溫操作，不需對提取藥劑進行特殊處理。所需時間短，1 h即可完成整個提取過程。提取完成后，利用RT-PCR技術鑒定病毒的種類，必要時進行序列測定。對于獲得的新的果樹病毒他們一般接種到指示植物進行生物學鑒定，以確定該病毒在果樹上的表現癥狀，用于該病毒的田間診斷。所謂指示植物，是指對某種或幾種病毒及類似病原物或株系具有敏感反應并表現明顯癥狀的植物。由于所有果樹病毒都可通過嫁接傳染,所以可以通過嫁接，使病毒從待檢植物傳到指示植物。在德國生產上常用的指示植物有：弗吉尼亞小蘋果(Virginia Crab)、司派227 (Spv227)、光輝 (Radiant)和蘇俄蘋果(R12740～7A)。其中，弗吉尼亞小蘋果可檢測莖痘病毒和莖溝病毒；司派227和光輝可檢測莖痘病毒；蘇俄蘋果可檢測褪綠葉斑病毒。指示植物鑒定法可在大田或溫室進行，也可采用試管嫁接方法在超凈工作臺上進行。關于蘋果病毒病的接種方法，德國研究學者主要應用摩擦接種和農桿菌侵染接種兩種方法。所謂摩擦接種果樹病毒，是將果樹病毒的提取液滴于健康植物的表面，利用摩擦方法造成的傷口以接種果樹病毒的方法。該方法操作簡單，轉染成功率一般在75%左右，其缺點是需要對大量的轉染植株進行鑒定。另一種接種果樹病毒的方法是農桿菌侵染接種法，該方法的操作步驟是首先利用RT-PCR技術克隆病毒的全長，構建該病毒的表達載體，最后利用農桿菌侵染的方法將病毒轉化進受體植物。該方法的操作過程比較復雜，但是對于新發現的一些果樹病毒，主要利用該方法進行接種鑒定。關于蘋果病毒病的保存，德國主要將帶有果樹病毒的材料應用嫁接保存。

2.2 植原體病害研究 果樹植原體病害是一種非常重要的細菌病害，果樹得病后能引起黃化、叢枝，發病嚴重的能引起果樹的死亡。該病由昆蟲進行傳播。由于目前世界上關于該病的代謝途徑和病原菌與寄主植物的互作研究甚少，因此JKI關于該病的研究主要集中在對該病的檢測、診斷、新病原菌發掘、寄主植物與病原菌的互作研究等方面。目前，德國對該病的防治方法研究主要集中在抗病新砧木的培育上，他們對抗病砧木的選育目標是選育出抗病性強、矮化的新型砧木。目前該所已選育出30多個抗病性強砧木，其中有2個砧木已經在意大利等國家進行區域性試驗。

3 蘋果病毒脫毒技術研究

因為蘋果病毒是通過嫁接傳染，一旦傳染上病毒，無有效藥劑防治。所以德國果樹病毒病的防治，主要通過栽培無病毒和抗病毒或耐病毒的品種。而采用無病毒苗木，是防治蘋果病毒病的最有效也是最根本的途徑。目前德國主要采用熱處理結合莖尖培養的方法獲得無病毒材料。其具體做法是：首先將植株在27～35℃預處理 1周，以增加其存活力，然后將蘋果苗置于34～36℃環境中生長3～4周，去除蘋果病毒。熱處理結束后，剝取1 mm左右的莖尖進行培養，然后通過檢測獲得無病毒的果樹材料。由于熱處理可脫除褪綠葉斑病毒、莖痘病毒，而莖尖培養易脫除莖溝病毒。所以將熱處理和莖尖培養相結合，可以使兩種方法互補，提高脫毒率，而且省去了熱處理后嫩梢嫁接環節，莖尖大小可切到1 mm，易分化出苗，可減少變異后代的發生率。該方法的脫毒率可達50%～83.3%。熱處理的材料一般分盆栽苗與組培苗兩種，熱處理方式可分為恒溫與晝夜高低變溫兩種。為了避免對植株的傷害，組培苗脫毒可用晝夜高低變溫方式。目前，該方法是德國研究人員普遍應用的脫毒技術。

此外，德國研究人員還利用在果園中選擇健壯、豐產的植株及新育成的品種（品系）進行病毒鑒定，確認無病毒后，培育成母本樹，以及直接從國外引進無病毒品種接穗，培育成母本樹；以及采用病毒抑制劑結合莖尖培養等方法獲得無病毒植株。目前，德國已經獲得了225個脫毒的果樹品種或品系。實現了對所有推廣果樹品種的脫毒處理，生產上實現了無毒化栽培。

4 德國病蟲害防控技術研究

德國生物防控中心于1970年組建，隸屬于德國作物研究中心（JKI）。目前該中心擁有職工55人，其中15個科學家，8個博士生，40個試驗工人。其主要以蟲害研究為主，注重生物防控技術和產品的研發。主要應用的生物防控手段包括以真菌、細菌、病毒、殺蟲燈、天敵等抑制果樹病蟲害的發展。近來，該中心研制了一種昆蟲病毒制劑，在謝花后噴灑可有效防治蘋小食心蟲，在德國已推廣200多hm2。他們還利用植物提取物防治果樹的真菌病害，他們在甘蔗中提取了一種多酚類活性物質，該物質不僅能殺死病菌芽孢，還能誘導目標植物產生抗性物質，對防治果樹一些真菌病害非常有效，目前正在進行大田試驗。

5 赴德國學習考察的感想與建議

5.1 針對煙臺市果樹病毒病的發生現狀，長期不斷地開展果樹病毒研究工作 病 毒 病是危害果樹的最重要的病害之一，果樹病毒病一旦發生，將給果樹生產帶來巨大的經濟損失。目前世界上對果樹病毒病沒有有效的防治方法。栽植無毒苗木是防治果樹病毒病的唯一途徑。德國政府對果樹病毒病十分重視，德國的果樹生產已經于上世紀90年代全部實現無毒化栽培。而我國果樹無毒化苗木計劃始于20世紀90年代，經過十幾年的發展，目前栽植無毒苗木的果園僅在3%左右。據調查，煙臺市蘋果園的果樹病毒病的帶毒率已高達60%以上，病毒病給我市帶來的經濟損失是巨大的。上世紀90年代中期，我市科研單位開始開展蘋果病毒病的研究，由于種種原因，進展一直非常緩慢。直到最近幾年，才又重新開始蘋果病毒病研究和脫毒工作。而且我們現在開始的研究工作僅限于果樹品種的脫毒和檢測等基礎性工作，而德國的果樹病毒研究重點已經轉入病毒的致病機理、病毒與寄主植物的互作等研究領域，我國的果樹病毒研究工作與德國相比還存在很大的差距。因此，對果樹病毒病的研究，應長期不間斷的持續開展。

5.2 進一步加強果樹病毒病研究的國際間科技合作 目前，果樹病毒病的研究是一項全球化共同研究的課題。我國的果樹病毒病研究與西方發達國家相比，還存在較大差距。我們應該按照“請進來與走出去”相結合的思路，開展果樹病毒病基礎研究、無病毒果樹新品種的引進、病毒病的防控等果樹病毒病相關研究的國際間科技合作。同時，利用國外先進的果樹病毒病研究的最新成果，解決我國果園的病毒病問題。

此外，培訓團從德國引進了部分性狀優良的蘋果、梨、葡萄等優良品種和砧木資源，豐富了我國的果樹種質資源。通過學習，對德國果樹病毒病的研究現狀、最新的研究手段和方法、果樹育種和生產科研現狀，有了較為細致的了解。與德國作物研究中心植物保護和葡萄栽培研究所建立了良好的友好合作關系，拓寬了科研合作的范圍，而且雙方共同申報了中德政府間科技合作項目，為今后互派人員進行果樹交流合作，加強國際間的合作與交流奠定了基礎。這些國際合作和交流將極大地提升我國特別是煙臺地區病毒病科研水平。