聚（NIPAAM－EDMA）整體柱的制備及其對尿樣中氫化可的松的富集分析

賈艷花，劉海燕，楊寧，段艷慧，楊更亮

（河北大學藥學院，河北保定 071002）

聚（NIPAAM－EDMA）整體柱的制備及其對尿樣中氫化可的松的富集分析

賈艷花，劉海燕，楊寧，段艷慧，楊更亮

（河北大學藥學院，河北保定 071002）

以N－異丙基丙烯酰胺（NIPAAM）為單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯劑，制備了一種能有效去除尿樣中的大分子物質，并能同時富集尿樣中氫化可的松的整體柱.實驗結果表明：氫化可的松在5～30 mg／L線性關系良好（R＝0.999 3，n＝6），檢測限為0.012 mg／L；絕對回收率79%～83%；日內、日間精密度均＜5.0%，整體柱能夠很好地富集尿樣中的氫化可的松，并且能很好地除去尿樣中的大分子物質及雜質，能滿足分析的要求.

N－異丙基丙烯酰胺；整體柱；富集分析；氫化可的松

整體柱又稱為棒狀柱、連續床層、無柱塞柱，是一種用有機或無機聚合方法在色譜柱內進行原位聚合的連續床固定相，作為一種新型的分離介質已經用在液相色譜和毛細管色譜上［1－2］.自20世紀80年代末出現以來，合成了不同種類的整體柱新型材料，并通過在固定相上做不同的衍生制備了很多具有功能性的整體柱.氫化可的松是天然的皮質激素類的藥物，有抗炎、抗毒、抗休克的作用.目前人們對樣品中氫化可的松及其他激素類藥物的分析主要是高效液相色譜法［3－4］、反向流動注射－化學發光法［5］、高效液相色譜－質譜法［6］、氣相色譜法－質譜法［7］等，但均操作較復雜，過程較繁瑣.本實驗以N－異丙基丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，偶氮二異丁腈作為引發劑，制備了一種新型整體柱材料，整體柱做為尿樣中氫化可的松的富集柱，能夠除去尿樣中的生物大分子物質和尿樣中其他成分的干擾，對氫化可的松有很好的保留，實現對氫化可的松的快速、簡便、有效富集，并聯合C18柱進行分析測定.

圖1 氫化可的松的結構式Fig.1 Chemical structure of hydrocortisone

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器：P3000高效液相色譜儀（中國，北京創新通恒科技有限公司）；UV－3000紫外／可見分光檢測器（中國，北京創新通恒科技有限公司）；色譜工作站CXT H－3000（北京創新通恒科技有限公司）；ODS C18柱（依利特，150 mm×4.6 mm i.d.，5μm）；不銹鋼空色譜柱管（10 mm×4.6 mm i.d.）；SZ－97自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；HH－601超級恒溫水浴（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）.

N－異丙基丙烯酰胺（NIPAAM，分析純，日本Tokyo Kasei Kogyo公司），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，分析純，美國acros公司），十六醇（分析純，天津天泰化工精細化學品有限公司），偶氮二異丁腈（AIBN，分析純，上海試劑四赫維化有限公司），甲醇（分析純，北京益利精細化學品有限公司）；尿液由健康志愿者提供.

1.2 整體柱的制備

將NIPAAM（0.075 g），EDMA（0.7 m L），AIBN（0.003 g），十六醇（0.045 g），甲醇（1.3 m L）依次加入到試管中，經混合、超聲、通氮氣10 min，轉移到干凈、干燥的不銹鋼色譜柱管中，抽真空20 min密封，在60℃恒溫的條件下反應24 h.將取出的柱體放至常溫后，分別用甲醇和水沖柱，將柱中的殘余的致孔劑和其他可溶性的物質除去，即可得到整體柱.

1.3 樣品的制備

精密稱取適量的氫化可的松制備成1.0 g／L的標準儲備液（放于冰箱中保存），用于配制5～30 mg／L的尿液樣品.

1.4 色譜分析的條件

富集柱：自制整體柱；流動相：水；流速：1.0 m L／min；檢測波長280 nm.

分析柱：C18柱（依利特，150 mm×4.6 mm i.d.，5μm）；流動相：甲醇－水（V（甲醇）∶V（水）＝60∶40）；流速1.0 m L／min；檢測波長245 nm.

1.5 樣品處理與色譜分析

將自制整體柱連接在高效液相色譜儀上，按照1.4節色譜條件，即先在280 nm處連接整體柱對尿樣中的藥物進行富集，富集完全后停泵，將C18柱與整體柱連接，在245 nm下進行分析.

2 結果與討論

2.1 整體柱的表征

2.1.1 柱壓和流速的關系

分別以甲醇和水為流動相考察了整體柱的柱壓降與流速的關系，從圖2可以看出柱壓降與流速呈良好的線性關系，隨著流速的增加，柱背壓呈現線性的變化，以甲醇為流動相，當流速為3 m L／min時，柱背壓為2.3 MPa，結合圖3可看出整體柱的骨架結構中具有大小不等的微孔，所以整體柱具有良好的通透性.

圖2 整體柱柱壓降與流速的關系Fig.2 Effect of flow rate on back pressure

2.1.2 掃描電鏡

圖3為整體柱的電鏡圖，聚合物的結構是由球形束和束間不規則的孔組成，束間孔相互貫通，可以通過流動相，為固相萃取提供比較大的表面積，而且也可用于高流速分析.

圖3 整體柱的電鏡Fig.3 SEM image of the cross sectional view of the monolithic column

2.1.3 紅外圖譜

由紅外圖譜4看出，3 100 cm－1附近的－C＝C－上特征峰消失，在1 180 cm－1處的酯鍵中－C－O－基的吸收峰在連接上EDMA后明顯地增強，在1 680 cm－1處－C＝O的吸收峰明顯增強.

圖4 整體柱的紅外譜Fig.4 FT－IR spectra of monolithic column

2.2 氫化可的松的富集及分析

2.2.1 流動相對藥物保留的影響

以水為流動相，以整體柱為色譜柱，取適量氫化可的松進樣，如色譜圖5b；在同樣條件下將等量的氫化可的松以空柱管為柱體進樣，如圖5a.從圖中可以看出以水為流動相時藥物保留強，基本不出峰，而空柱管出峰比較大，因此，以水做流動相可以很好地將藥物富集在整體柱上.

圖5 氫化可的松上樣于空柱管和整體柱Fig.5 Solution of Hydrocortisone injected into the connecting tube and the monolithic column

2.2.2 尿樣洗脫

以水為流動相，將5μL的空白尿樣直接進入整體柱，從圖6中可以看出尿樣在3 min之內出峰完畢.

圖6 空白尿樣洗脫色譜Fig.6 Chromatograms obtained from blank urine eluting

2.2.3 藥物的分析

按照1.5的操作，分別將5μL含有氫化可的松的尿樣和空白尿樣進樣，以水為流動相時，樣品通過整體柱富集，富集完全后，停泵；在儀器穩定后，串聯C18柱進行分析，將整體柱上富集的氫化可的松洗脫下來（色譜圖見圖7）.

圖7 空白尿樣和氫化可的松的色譜Fig.7 Chromatograms obtained from blank urine and urine spiked with hydrocortisone

從圖7可以看出，空白尿樣（圖7a）在藥物出峰的位置沒有雜峰出現，尿樣并不影響藥物的分析，而含有氫化可的松的尿樣（圖7b）在5.2 min處出現藥物峰，因此可用來對氫化可的松的富集分析.

2.3 方法性能指標考察

2.3.1 標準曲線

準確稱取氫化可的松標準儲備液，用尿液依次稀釋制備為質量濃度5，10，15，20，25，30 mg／L系列溶液.按照1.5節的操作，每個質量濃度進樣品3次.以色譜峰面積Y對血藥質量濃度X（mg／L）作圖，回歸方程為Y＝1.8691×103X－52.4，r＝0.999 3（n＝6），在5～30 mg／L內具有良好的線性.當儀器的信噪比（S／N）為3時，測得氫化可的松的檢測限0.012 mg／L.

2.3.2 精密度和回收率

準確配制氫化可的松5，15，30 mg／L 3種質量濃度尿液樣品和同質量濃度的對照液各5份，尿液樣品按照1.5節的過程進樣分析，對照液直接進C18柱分析.用上面所得的值計算日內、日間精密度及其回收率、絕對回收率.具體結果見表1.

表1 尿樣中氫化可的松的精密度、回收率、準確度Tab.1 Precision accuracy and recovery of hydrocortisone in urine sample

3 結論

實驗采用自制的整體柱作為富集柱，能夠除去尿樣中的大分子，尿樣無需處理可以直接進樣，避免了生物樣品繁瑣的預處理過程.實驗結果表明本方法具有良好的線性范圍、回收率和精密度，能夠滿足生物樣品分析測定的要求，本整體柱制備簡單，重復利用，成本低廉，為檢測樣品中痕量藥物的簡便、快速、有效方法.

［1］J SCOTT MELLORS，JAMES W JORGENSON.Use of 1.5μm porous ethyl－bridged hybrid particles as a stationary phase support for reversed－phase ultrahigh－pressure liquid chromatography［J］.Anal Chem，2004，76（18）：5441－5450.

［2］GUIOCHON G.Monolithic columns in high－performance liquid chromatography［J］.Chromatogr A，2007，1168：101－168.

［3］陳永紅，葉蔚云.高效液相色譜法測定食品中甾體激素殘留量的方法研究［J］.中國公共衛生，1997，13（11）：696－697.

CHEN Yonghong，YE Weiyun.Determination of the residue steroid hormones in food by HPLC［J］.Chinese Journal of Public Health，1997，13（11）：696－697.

［4］饒艷輝，胡虹，周學琴.高效液相色譜法測定血液中丙酸倍氯米松的含量［J］.中國現代醫藥雜志，2008，10（2）：41－42

RAO Yanhui，HU Hong，ZHOU Xueqin.Determination of the content of beclomethasone dipropionate in blood by HPLC［J］.Modern Medicine Journal of China，2008，10（2）：41－42.

［5］范順利，李薇，林金明，等.反相流動注射－化學發光法測定氫化可的松［J］.分析化學，2004，32（11）：1421－1425.

FAN Shunli，LI Wei，LIN Jinming，et al.Reverse flow injection chemiluminescence determination of hydrocortisone）［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2004，32（11）：1421－1425.

［6］賀利民，黃顯會，方炳虎，等.超高效液相色譜－串聯質譜法測定動物肌肉組織和雞蛋中殘留11種甾體激素類藥物［J］.色譜，2008，26（6）：714－719.

HE Limin，HUANG Xianhui，FANG Binghu，et al.Determination of eleven steroid hormones in animal muscle tissues and eggs using ultra－performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Chinese Journal of Chromatography，2008，26（6）：714－719.

［7］S IMPENS，J VAN LOCO，J M DEGROPEAN，et al.A downscaled multi－residue strategy for detection of anabolic steroids in bovine urine using gas chromatography tandem mass spectrometry（GC－MS3）［J］.Analytica Chimica Acta，2007，586：43－48.

Preparation of poly（NIPAAM－EDMA）monolithic column for enriching and analyzing hydrocortisone from urine

JIA Yan－hua，LIU Hai－yan，YANG Ning，DUAN Yan－hui，YANG Geng－liang
（College of Pharmacy，Hebei University，Baoding 071002，China）

A new monolithic column have been prepared which was composed of copolymer that theN－isopropylacrylamide（N－IPAAM）was the monomer and the ethyleneglycoldimethacrylate（EDMA）was the cross－linker.The monolith was used for removing the macromoleculer and enriching the hydrocortisone in urine sample.The result showed that hydrocortisone had a good linear（R＝0.999 3，n＝6）when the concentration of the hydrocortisone in the range of 5－30 mg／L，the limit of detection（LOD）was 0.012 mg／L.The absolutely recovery was 79%－83%.The inter－day RSD and intra－day RSD was less than 5%.This method is conforming to analysis.

N－isopropylacrylamide；monolithic column；enrichment analysis；hydrocortisone

R917

A

1000－1565（2012）02－0154－05

2011－10－20

國家自然科學基金資助項目（21175031），河北省科技廳資助項目（11966411D）；河北省教育廳資助項目（2008416，ZD2010234）；科技部“重大新藥創制”科技重大專項“十二五”計劃第二批課題（2012ZX09103－101－057）；河北大學自然科學基金資助項目（2009－165）.42

賈艷花（1984－），女，河北行唐人，河北大學在讀碩士研究生.

劉海燕（1971－），女，河北保定人，河北大學副教授，主要從事色譜分離材料的制備及應用研究.

E－mail：lhy1610＠126.com

梁俊紅）