4種昆蟲基因組中的線粒體假基因

楊明茹，周志軍，常巖林，張艷霞

（河北大學生命科學學院，河北保定 071002）

4種昆蟲基因組中的線粒體假基因

楊明茹，周志軍，常巖林，張艷霞

（河北大學生命科學學院，河北保定 071002）

為了進一步了解昆蟲核基因組中線粒體假基因（Numts）序列分布情況，避免Numts序列對基于線粒體DNA（mt DNA）進行系統發育關系研究結果的誤導，利用Blast N對GenBank中已完成核基因組和mtDNA測序的4種昆蟲核基因組中的Numts序列進行檢索，結果表明：岡比亞按蚊Anophelesgambiae中沒有Numts序列；黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中僅有少量Numts序列；赤擬谷盜Triboliumcastaneum和意大利蜜蜂Apismellifera基因組中Numts序列超過100條，尤其是意大利蜜蜂中的Numts序列涵蓋全部mtDNA.ND2，ND4，ND5，COⅠ與lrRNA向核內轉移頻率高于其他mt DNA基因片段，因此，在使用其進行系統發育關系研究時需加倍謹慎.

mt DNA；Numts；基因組

線粒體DNA（mt DNA）具有結構簡單、進化速率快和母系遺傳等特征，是研究基因組結構和基因表達的良好模型，同時也是在分子進化和系統發育研究中應用最廣的分子標記［1］.隨著聚合酶鏈式反應（PCR）和DNA測序技術的發展，mtDNA作為分子標記被廣泛用于不同類群的系統進化和群體遺傳結構研究［2－4］.

線粒體假基因（nuclear mitochondrial pseudogenes，Numts）是在核基因組中發現的、與mtDNA高度相似的DNA片段［5］，通常被認為是mtDNA向核基因組轉移的結果，在真菌、無脊椎動物、脊椎動物和植物中都有Numts存在［6－8］.由于核基因組中的Numts序列進化速率較mt DNA慢，更接近于mtDNA的祖先序列［9－12］，因此，在使用通用引物進行擴增時，核基因組中的Numts極易被優先擴增出來或與mt DNA靶序列一起擴增出來［13－15］.Numts序列的存在不僅增加了獲得mt DNA靶序列的難度，而且如果將Numts序列誤作為mtDNA靶序列使用，甚至會得出錯誤的結論［14－17］.Sorenson等［18］分別將在斑胸樹鴨Dendrocygnaarcuata中發現的COⅠ－Numts序列和mtDNA基因序列用于樹鴨屬系統發育關系分析，發現其分支拓撲結構完全不同.同時，Numts也可為系統進化研究提供有益的線索［16，19］，與內含子、衛星序列和轉位因子等冗余DNA一樣，Numts不受進化的選擇作用，保留著更多的祖先特征，可以為物種的分子進化研究提供大量的信息［20］，比如，人們已把Numts作為分子標記，對人［21］和擬南芥［22］進行了研究.

mtDNA向核內轉移現象非常普遍.2001年，Bensasson等［19］統計發現在80余種真核生物（包括20余種昆蟲）中存在Numts序列.此后，Numts在弄蝶［23］、蜜蜂［24］、螞蟻［25］、蟬［26］、石蛃［27］等類群中被報道.在Genbank中，以“Insecta Numt”作為關鍵詞，進行Numts序列檢索，共獲得881條Numts序列，隸屬于昆蟲綱6個目，分別為直翅目、鱗翅目、膜翅目、石蛃目、雙翅目和半翅目；涵蓋7種基因類型，分別為COⅠ（部分）、ND5（部分）、COⅠ（部分）－trn L－COⅡ（部分）、trn L－COⅡ（部分）、ND2（部分）－COⅠ（部分）、COⅢ（部分）、ATP6（部分）［23，25－27，28－35］.

此前關于Numts的報道，都是基于單一物種基因組中的Numts分析，且不同研究所使用的參數設置也不盡相同，難以進行比較.為了進一步深入了解昆蟲核基因組中Numts序列分布情況，對基因組序列組裝基本完成（Y染色體除外）的4種昆蟲中的Numts序列的大小、數目及分布特點等進行了研究.

1 材料與方法

1.1 實驗數據來源

從公共數據庫NCBI中下載物種的基因組數據，見表1.

表1 實驗物種及基因組數據來源Tab.1 Specimens and data collection of the genome

1.2 實驗方法

分別以mt DNA編碼的37個基因（13個蛋白質編碼基因、22個tRNA基因和2個r RNA基因）為誘餌序列，在NCBI中逐個對其核基因組序列進行Blast N同源性序列比對檢索，分別統計4種昆蟲基因組不同染色體上的Numts序列.在進行Numts序列統計時，為避免假陽性和減少遺漏早期進化的Numts序列，選擇了較保守的期望值（E值為10－4）［6，44－46］，沒有統計序列長度≤50 bp的檢索結果，同時，對相鄰位點的Numts序列進行核查以確定他們是否屬于同一Numts序列.

2 結果

2.1 4種昆蟲核基因組中的Numts分布

NCBI－Blast N同源性序列分析結果（如表2）：岡比亞按蚊基因組中沒有檢測到Numts；黑腹果蠅中檢測到25條Numts序列，總長度為2.634 kb，其中，最長的Numts序列長度為541 bp，對應于mt DNA的ND2（部分）和COⅠ（部分）及它們之間的3個tRNA基因簇（trn W－trnC－trn Y）.赤擬谷盜中檢測到123條Numts序列，總長度為18.485 kb，其中，最長的Numts序列長度為951 bp，對應于mtDNA的ND4（部分）；意大利蜜蜂中的Numts含量最多，共檢測到994條Numts序列，總長度達327.102 kb，其Numts序列已涵蓋mt DNA的全部序列.其中，最長的Numts序列長度為1 267 bp，對應于mtDNA的4個tRNA基因（trn M－trn Q－trn A－trnI）和整個ND2.所檢測到的Numts序列長短不一，但大多數小于300 bp（表2）.

表2 4種昆蟲基因組中的Numts大小分布（Blast N檢索E值為10－4）Tab.2 Size distribution of Numts in four insect genomes detected by Blast N at a threshold of 10－4

圖1 4種昆蟲基因組中染色體長度及Numts序列分布情況Fig.1 Chromosome length and the distribution of Numts in four insect genomes

2.2 不同染色體中的Numts分布

4種昆蟲基因組中，不同染色體上的Numts分布情況如圖1所示，黑腹果蠅的5個常染色體和1個X染色體，赤擬谷盜的9個常染色體和1個X染色體及意大利蜜蜂的15個常染色體和1個X染色體中都有Numts分布.其中，黑腹果蠅的4號染色體、赤擬谷盜的3號染色體，意大利蜜蜂的X染色體檢測到的Numts序列最多，總長度分別為0.81，5.40，38.20 kb；而黑腹果蠅的2L號染色體，赤擬谷盜的2號和10號染色體，意大利蜜蜂的9號染色體檢測到的Numts序列最少，長度分別僅為0.11，0.54，9.68 kb.意大利蜜蜂的Numts含量明顯高于赤擬谷盜與黑腹果蠅，僅Numts序列含量最少的9號染色體的Numts數目都遠高于黑腹果蠅基因組的整體Numts量.

2.3 不同線粒體基因向核內轉移頻率差異分布

mtDNA中，不同的基因片段向核內轉移的頻率不同，其中，重排發生頻繁、長度較短的tRNA基因的轉移頻率較低，而位置相對固定，長度較長的蛋白質編碼基因和rRNA基因的轉移頻率較高，ND2，ND4，ND5，COⅠ與lrRNA基因的轉移的次數較高（如圖2）.

圖2 不同mt DNA編碼基因對應的Numts數量Fig.2 Numbers of Numts of different mt DNA encoding genes

3 討論

3.1 4種昆蟲基因組中Numts序列比較

生物在長期進化過程中，mtDNA向核內轉移已被證實，并且很可能仍在持續進行之中，已經報道的不同物種mtDNA向核內轉移的數量差異很大［6－7］.

基于相同的參數設置，對4種昆蟲基因組中的Numts序列進行研究發現：2種雙翅目昆蟲基因組中沒有或僅含有少量Numts，鞘翅目的赤擬谷盜基因組中Numts數量較多，膜翅目意大利蜜蜂基因組中的Numts數量最多，與之前的報道基本一致［6－7，24，47］.

本研究發現岡比亞按蚊、黑腹果蠅、赤擬谷盜和意大利蜜蜂基因組的Numts序列總長度分別為0，2.6，18.5，327 kb.之前報道黑腹果蠅基因組的Numts序列總長度分別為0.5［6］，10.3［7］和0.8 kb［24］，赤擬谷盜中分別為31.2 kb［7］和8.8 kb［24］，意大利蜜蜂中分別為0［48］，172［7］，237 kb［24］和272 kb［47］.Pamilo等［24］發現赤擬谷盜中ND4與ND5的轉移頻率很高，約占總量的1／2；筆者發現lrRNA的轉移頻率同樣很高，三者約占總量的2／3.Behura等［47］發現意大利蜜蜂的10號染色體Numts含量最少，COⅠ轉移頻率最高；而本課題組發現9號染色體Numts序列最少，ND2轉移頻率高于COⅠ.造成上述差異的主要原因可能是由于實驗參數設置和基于的基因組組裝版本差異.所檢測到的Numts序列長度多數小于300 bp（表2），表明較小的基因片段具有更高的向核內轉移效率.

此前報道在蚱蜢［28］、蚜蟲［49］、伊蚊［30］和沙漠蝗［50］的一些基因具有很高的轉移頻率，而在一些虎甲中Numts卻十分罕見［51］.由于蚱蜢和蚜蟲是不完全變態昆蟲，而岡比亞按蚊、黑腹果蠅、意大利蜜蜂、赤擬谷盜及虎甲都是完全變態昆蟲.赤擬谷盜和意大利蜜蜂基因組中檢測到大量Numts序列，推翻了此前關于完全變態昆蟲中缺乏Numts的觀點［51］.

本研究涉及的4種昆蟲基因組大小差異不大，因此，不能用“基因組越大Numts越多”的觀點［7］解釋這些物種間Numts的數量差異.Hazkani－Covo等［52］發現人類基因組中的Numts序列僅30%來自mt DNA直接轉移，其余70%則由轉移后的mt DNA片段在核內復制、轉座而成.Tourmen等［53］發現一些重復的Numts的側翼區域都是長末端重復序列（LTR），表明核基因組中存在Numts序列復制、轉座的機制.此前，有報道認為意大利蜜蜂基因組的重組率遠高于黑腹果蠅和岡比亞按蚊［54］，那么基因組中Numts數量變化是否與基因組的重組率具有一定相關性？仍有待于進一步的研究.

3.2 Numts序列對分子進化研究的影響

mtDNA向核內轉移的頻率決定于細胞內的競爭強度、父系基因滲透概率和物種種群數量［55］.隨著在更多物種中的Numts序列發現，如何處理其對分子進化研究的影響成為我們不得不面對的問題.

首先，在使用通用引物對mt DNA基因進行擴增時，應盡量選擇線粒體含量較豐富的組織或器官［56］；其次，可以通過設計特異性引物、以長距PCR產物為模板進行二次PCR，RT－PCR等方法避免Numts序列干擾［19，56－58］；最后，可以通過Numts序列特征識別所獲得數據中的假基因.蛋白質編碼基因對應的Numts序列，通常會由于堿基替換或插入／缺失導致移碼突變或終止突變.例如，周志軍等［35］利用線粒體COⅠ基因片段進行暗褐蟈螽不同地理種群間的遺傳分化研究時，發現5條COⅠ－Numts序列，其長度略短于mtDNACOⅠ，存在2處堿基缺失（3 bp和21 bp），在另外2條COⅠ－Numts中還存在額外的1 bp缺失.除了這些明顯的Numts特征外，也可以通過翻譯后的氨基酸序列是否發生保守位點突變加以判斷.Sorenson等［59］在熊斑樹鴨核基因組發現COⅠ－Numts與mtDNA－COⅠ相比，不存在堿基插入／缺失，異常的終止密碼子，但其氨基酸序列有7個保守位點發生了變化.對于tRNA和rRNA基因，Numts序列識別顯得更復雜，有些學者提出可以通過比較序列的二級結構來識別Numts［60］.

核內Numts序列在給基于mtDNA的分子進化研究帶來困難的同時，也提供了一個新的有力工具.首先，可以根據Numts中保留的基因信息確定物種之間的親緣關系和進化距離.通過分別構建mt DNA和Numts的進化關系樹，可以確定mt DNA和Numts，不同Numts之間的分歧時間.例如，張鳳英等采用上述方法發現在擬穴青蟹的同一個體中存在2類Numts序列，分別代表了2次核整合事件［61］.其次，可以作為系統發育研究的外群.例如，在人類起源問題的研究中，Zischler等［62］使用人類核基因組中的一段D－loop區的Numts序列作為外群，證實了現代人類起源于非洲的假說，結束了很久以來關于現代人類起源地的爭論.Hay等［63］用cytb－Numts作為外群，構建系統發育樹分析發現爬行類的Sphenodonpunctatus僅僅是Sphenodonguntheri的同物異名.第三，Numts序列作為分子標記.同一段Numts序列在近源種間是否存在及其變異程度，可以反映物種間的親緣關系遠近.Sato等［64］分別使用Numts序列和mtDNA序列，重建了達爾文雀系統發育關系，結果顯示，2種序列建立的系統發育樹分支拓撲結構基本一致.Hazkani－Covo利用Numts序列構建了5種靈長類動物系統發育樹，結果支持人類－黑猩猩的姊妹群關系［65］.

綜上所述，Numts序列給基于mt DNA的分子進化研究帶來挑戰的同時，也帶來了新的契機.相信隨著更多物種基因組測序計劃的完成，對Numts序列研究的逐步深入，Numts序列必將在分子進化研究中展現更大的價值.

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Nuclear mitochondrial pseudogenes in four sequenced insect genomes

YANG Ming－ru，ZHOU Zhi－jun，CHANG Yan－lin，ZHANG Yan－xia
（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

The aim of this study was to have further information about the distribution of nuclear mitochondrial pseudogenes（Numts）in insect genomes，and to avoid misguidance of Numts sequences in the molecular phylogeny based on mt DNA.Sequences alignment（NCBI－Blast N）was carried out with mitochondrial and corresponding nuclear genome sequences in 4 insect species.The results showed：copy number ranges from none in the African malaria mosquitoAnophelesgambiae，few copies in the fruit flyDrosophilamelanogaster，to more than 100 in the flour beetleTriboliumcastaneumand the honeybeeApis mellifera，especially inA.mellifera，Numts spanned the whole mtDNA.The reconstructed frequency ofND2，ND4，ND5，COⅠandlr RNAintegrations into the nucleus were higher than other mitochondrial genes.So，it needed for doubly cautious when using it for the study of phylogenetic relationships.

mt DNA；Numts；g enome

Q96

A

1000－1565（2012）02－0165－08

2011－09－12

教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（20101301120006）

楊明茹（1984－），女，河北保定人，河北大學在讀碩士研究生.

周志軍（1980－），男，山西長治人，河北大學講師，博士，主要從事直翅目線粒體基因組學研究.E－mail：zhijunzhou＠163.com

趙藏賞）