山苦菜嫩莖直接分化無性系的建立

張卓，王艷，王曉旭，李慧，姜長陽

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116081）

山苦菜嫩莖直接分化無性系的建立

張卓，王艷，王曉旭，李慧，姜長陽

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116081）

為了保護(hù)山苦菜資源，滿足人們對種苗栽培的需求，分別以山苦菜莖尖、葉片、葉柄和無芽嫩莖為外植體，進(jìn)行直接分化不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng).結(jié)果表明：嫩莖是直接分化出不定芽的理想材料，最佳分化培養(yǎng)基為MS＋BA 0.5 mg／L＋I(xiàn)BA 0.5 mg／L＋KT 0.5 mg／L＋蔗糖30 g／L；1／4 MS＋I(xiàn)AA 0.2 mg／L＋蔗糖20 g／L是分化芽生根的理想培養(yǎng)基；山苦菜再生苗移栽的理想基質(zhì)是1／2園土＋1／2河沙，移栽成活率為98.4%，移栽成活苗定植的成活率為98.8%.本實(shí)驗(yàn)證明：在適宜條件下可由嫩莖直接分化建立起山苦菜無性系.

山苦菜；直接分化；生根；無性系

山苦菜（Ixerischinensis），又名苦碟子、盤爾草、秋苦荬菜、鴨子食等［1－2］，屬菊科，苦荬菜屬多年生草本植物［3］.山苦菜既可食用又可藥用，全草入藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎等功效.現(xiàn)代藥理研究表明：山苦菜具有保肝抗炎、抗氧化、抗煙堿、抗病毒和抗白血病等藥效［4］.山苦菜新鮮莖葉具有適口性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為人們極為喜愛的野菜和家禽、家畜喜食的青飼料［5］.研究者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在早春大連市場上，山苦菜的嫩芽價(jià)格達(dá)200元／kg.人們的大量食用和很高的售價(jià)，使得以根莖繁殖為主的山苦菜野生資源的分布和數(shù)量都急劇減少，有的地區(qū)已成為瀕危野菜.現(xiàn)在，在大連郊區(qū)已經(jīng)很難采到野生山苦菜.因此，尋求山苦菜快速繁殖的方法顯得尤為重要.此前已多有關(guān)于苦荬菜屬植物的研究報(bào)道［6－9］，多集中于其食用及藥用價(jià)值方面，迄今未見山苦菜組織培養(yǎng)、外植體直接分化并建立無性系的報(bào)道.本研究采用組織培養(yǎng)的方法，進(jìn)行山苦菜直接分化的研究，建立山苦菜的高效離體再生體系，為滿足人們對種苗的需要，并為山苦菜的野生資源的保護(hù)、轉(zhuǎn)基因研究和基因庫的建立提供技術(shù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料滅菌及培養(yǎng)條件

將采自大連郊區(qū)山坡上生長旺盛的山苦菜植株用清水沖洗干凈后，剪成若干5 cm左右的小段，放到500 m L的磨口廣口瓶中，用自來水振蕩洗滌10～20 min后，用體積分?jǐn)?shù)0.05%的安利洗滌液洗滌約10 min，接著用無菌水震蕩洗滌至無泡沫后置于超凈工作臺上，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇滅菌10～15 s后，迅速用無菌水振蕩洗滌3～5次，加入質(zhì)量濃度0.5 mg／L的HgCl2溶液浸泡13 min，緊接著用無菌水洗滌4～5次［10］，將無菌材料轉(zhuǎn)移到覆有干凈無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干材料表面的水分，待剪切接種［11］.培養(yǎng)基中瓊脂的質(zhì)量濃度為5.0 g／L，p H 5.8～6.0，持續(xù)光照時(shí)間為12 h／d，光強(qiáng)2 000～4 000 lx，培養(yǎng)溫度15～27℃［12］.

1.2 方法

1.2.1 不同種類及不同質(zhì)量濃度激素對莖尖、葉片、葉柄和嫩莖直接分化的影響

從無菌材料上剪取莖尖、葉片、葉柄和莖段，其中葉柄和莖段長度為0.5～1.0 cm、葉片為邊長0.5 cm左右塊狀，莖尖長約0.8 cm.將以上4種材料分別接種于以MS為基本培養(yǎng)基并添加不同種類及不同質(zhì)量濃度激素的培養(yǎng)基上，置于光照恒溫條件下進(jìn)行直接分化的誘導(dǎo)培養(yǎng).直接分化實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)50個材料.

1.2.2 不同生長素對分化芽生根的影響

將嫩莖分化的分化芽從基部剪下，接種到以MS為基本培養(yǎng)基，分別附加IAA 0.2 mg／L，IBA 0.2 mg／L，NAA 0.2 mg／L，2，4－D 0.2 mg／L和蔗糖30 g／L的培養(yǎng)基上.接種時(shí)嫩莖植物學(xué)形態(tài)學(xué)下部的生長點(diǎn)接觸到培養(yǎng)基（下同），于變溫光照條件下進(jìn)行生根培養(yǎng).不同生長素對山苦菜分化芽生根的影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)80個材料.

1.2.3 不同碳源及其質(zhì)量濃度對分化芽生根的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，附加的生長素為IAA 0.2 mg／L，分別采用蔗糖、葡萄糖和麥芽糖作為碳源并設(shè)置質(zhì)量濃度梯度，將分化芽從基部剪下接種到各培養(yǎng)基中，于變溫光照條件下進(jìn)行生根培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)80個材料.

1.2.4 不同基本培養(yǎng)基對分化芽生根的影響

選用通過上述實(shí)驗(yàn)確定的生長素和碳源，即IAA 0.2 mg／L和蔗糖20 g／L附加到1／4 MS，1／2 MS，MS，B5，N6和White 6種不同的基本培養(yǎng)基中，再把從基部剪下的分化芽接種到上述培養(yǎng)基上后，于變溫光照條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中每種培養(yǎng)基接種80個分化芽，重復(fù)2次.

1.2.5 試管苗生根繼代培養(yǎng)

從生長旺盛的生根試管苗上剪取具有2個生長點(diǎn)的莖段，接種到篩選出的理想生根培養(yǎng)基上，于變溫光照條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，共接種50個莖段.生根繼代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)繼代培養(yǎng)6代，接種培養(yǎng)200個莖段.

1.2.6 試管苗的移栽與定植

將培養(yǎng)著生長旺盛，根系發(fā)達(dá)試管苗的培養(yǎng)瓶打開瓶塞，煉苗4 d后移栽到上半層分別為干凈河沙、爐灰渣和1／2園土＋1／2河沙，下半層為肥沃園土的溫室花盆中，移栽實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，共移栽550株.

把在溫室中移栽成活的試管苗定植到山坡下水庫旁的開墾地上，共定植500株.

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用spss17.0進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類及不同質(zhì)量濃度激素對莖尖、葉片、葉柄和嫩莖直接分化的影響

觀察表明，培養(yǎng)至第6天，個別莖尖的生長點(diǎn)處開始抽芽，但只生長1個芽且向上生長，芽較小且呈黃綠色，長勢較弱；葉片邊緣、葉柄兩端均開始膨大；莖段無明顯變化.培養(yǎng)20 d，莖尖抽出的嫩芽仍較短，且大多已經(jīng)開始脫分化形成愈傷組織，葉片邊緣和葉柄兩端形成了白色或淡黃色的愈傷組織，莖段已由兩端或一端切口直接分化出不定芽（以下稱為分化芽），一般抽出2～3個葉片（呈嫩綠色向四周生長）；培養(yǎng)至第45天觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1.由表1可見，4種材料在MS＋BA 0.5 mg／L＋I(xiàn)BA 0.5 mg／L＋KT 0.5 mg／L這一培養(yǎng)基中的分化率均為最高值，但莖尖、葉片和葉柄分別僅為22%，14%和26%，且葉片和葉柄上的分化芽都是由愈傷組織分化而來，出現(xiàn)的愈傷組織團(tuán)塊較大，分化芽長勢較弱且畸形苗較多.而以莖段為材料，不僅分化率達(dá)到了100%（平均每個莖段分化出56個高度為2.1～3.4 cm的直接分化芽），而且分化芽向四周生長，長勢較好，葉為鮮翠綠色，每個不定芽具3～6個生長點(diǎn)，整體呈團(tuán)簇狀，無畸形苗，外觀生長狀態(tài)良好，充滿整個三角瓶底部（圖1）.由此可見，MS＋BA 0.5 mg／L＋I(xiàn)BA 0.5 mg／L＋KT 0.5 mg／L這一培養(yǎng)基是誘導(dǎo)莖段直接分化芽的理想培養(yǎng)基.

圖1 山苦菜莖段的直接分化團(tuán)簇狀分化芽Fig.1 Cluster direct differentiation buds f rom tender stems of Ixerischinensis

表1 不同激素配比對山苦菜不同材料直接分化的影響Tab.1 Effects of different hormone combinations on direct differentiation with different explants of Ixerischinensis

2.2 不同條件對分化芽生根的影響

2.2.1 不同生長素對分化芽生根的影響

生根培養(yǎng)28 d觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表2.由表2可見，在添加IAA，IBA和NAA的培養(yǎng)基上生根率均為100%，且以IAA為生長素進(jìn)行生根的分化芽長勢最好（圖2）.觀察發(fā)現(xiàn)，分化芽培養(yǎng)至第5天開始生根，從平均生根數(shù)、根長以及苗長勢等方面看，變溫條件下有利于山苦菜分化芽生根的生長素依次為IAA，IBA，NAA和2，4－D.因此，IAA是山苦菜分化芽生根的理想生長素.

表2 不同生長素對分化芽生根的影響Tab.2 Effects of different auxins on rooting of differentiated buds

2.2.2 不同碳源及其質(zhì)量濃度對山苦菜分化芽生根的影響

接種后每隔7 d觀察1次生根情況并進(jìn)行詳細(xì)記錄，培養(yǎng)至第28天進(jìn)行第4次觀察，結(jié)果見表3.觀察發(fā)現(xiàn)分化芽培養(yǎng)6 d左右開始生根，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基對根的誘導(dǎo)效果要好于葡糖糖和麥芽糖，且添加蔗糖20 g／L的培養(yǎng)基上平均根數(shù)最多、根平均最長且苗長勢最好（圖3）.因此蔗糖為誘導(dǎo)山苦菜分化芽生根的理想碳源，理想質(zhì)量濃度為20 g／L.

圖2 IAA對生根的誘導(dǎo)Fig.2 Rooting inducing of IAA

圖3 20 g／L的蔗糖對生根的誘導(dǎo)Fig.3 Rooting inducing of sucrose 20 g／L

表3 不同碳源對分化芽生根的影響Tab.3 Effects of different carbon sources on rooting of differentiated buds

2.2.3 不同基本培養(yǎng)基對山苦菜分化芽生根的影響

觀察表明，接種到培養(yǎng)基中的第4天已有植株開始生根，培養(yǎng)至第28天時(shí)對生根率、平均生根數(shù)、根的長度等進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表4.在糖與激素相同的條件下，6種基本培養(yǎng)基中以1／4 MS為基本培養(yǎng)基時(shí)分化芽生根狀態(tài)最好（圖4）.在1／4 MS＋I(xiàn)AA 0.2 mg／L＋蔗糖20 g／L這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的分化芽，不僅生根率100%（平均每株試管苗生根6.80條（最多），每條根的平均長度3.99 cm），而且生根試管苗長勢好，同時(shí)上根系白嫩.因此，1／4 MS是山苦菜分化芽生根的理想基本培養(yǎng)基，1／4 MS＋I(xiàn)AA 0.2 mg／L＋蔗糖20 g／L是山苦菜分化芽生根培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基.

表4 不同基本培養(yǎng)基對分化芽生根的影響Tab.4 Effects of different basic mediums on rooting of differentiated buds

2.2.4 試管苗生根繼代培養(yǎng)與快速繁殖

生根繼代培養(yǎng)25 d后觀察統(tǒng)計(jì)：試管苗成活率和生根率均為100%，且植株長勢較好，葉片呈深綠色無枯葉（圖5），根系發(fā)達(dá).統(tǒng)計(jì)還證明，生根繼代增殖速度為4.8倍／25 d，且?guī)缀鯖]有無效苗.3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次繼代培養(yǎng)6代的結(jié)果基本一致.按照這種繁殖速度，理論上1株試管苗1年能繁殖出4.814.6株試管苗，即使除掉各種不利因素，也完全能達(dá)到快速繁殖、滿足栽培和研究需求的目的.

圖4 1／4 MS對生根的誘導(dǎo)Fig.4 Rooting inducing of 1／4 MS

圖5 生根繼代培養(yǎng)的試管苗Fig.5 Tube seedlings of rooting multiplication

2.2.5 試管苗的移栽與定植

移栽后30 d統(tǒng)計(jì)證明：移栽的理想基質(zhì)為1／2園土＋1／2河沙，移栽成活541株，成活率為98.4%.定植后30 d統(tǒng)計(jì)證明：定植成活488株，成活率為97.6%.定植成活的試管苗初期生長緩慢，后期生長速度加快，長勢旺盛，根系增加1倍左右，當(dāng)年開花結(jié)果.

3 討論

誘導(dǎo)山苦菜4種材料直接分化的實(shí)驗(yàn)證明：無芽嫩莖是最適合直接分化的外植體，這表明細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)的不同會導(dǎo)致不同組織在同種條件下產(chǎn)生不同的反應(yīng)［13］.當(dāng)培養(yǎng)基中添加的BA質(zhì)量濃度發(fā)生變化時(shí)，對山苦菜分化芽的誘導(dǎo)情況有顯著影響，最適質(zhì)量濃度為0.5 mg／L，這與藍(lán)桃菊等人［14］對羅漢果不同器官直接分化的研究結(jié)果一致.IAA是植物天然生長素，高質(zhì)量濃度抑制植物的生長，低質(zhì)量濃度促進(jìn)植物的生長，促進(jìn)細(xì)胞伸長和細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長與發(fā)育.已有研究表明，IAA對菊科植物生根的誘導(dǎo)效果較好［15］，本研究結(jié)果也證明IAA是誘導(dǎo)菊科植物山苦菜分化芽生根培養(yǎng)的最佳生長素.光不僅作為一種能源影響光合作用，還作為一種觸發(fā)信號影響植物生長及發(fā)育的許多方面，光照條件不同，植物生長狀態(tài)亦不同［16］，日光為山苦菜生根培養(yǎng)的最佳光照條件.前人的研究表明，作為人工合成的生長素2，4－D，是常見生長素中誘導(dǎo)愈傷組織作用最強(qiáng)的［17－19］，而對擬南芥試管苗生根抑制作用明顯［20］.本研究證明：在添加2，4－D的培養(yǎng)基上分化苗不生根，但在形態(tài)學(xué)下端出現(xiàn)了愈傷狀膨大，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)形成較多愈傷組織，這與前人的研究結(jié)果一致.

邱奉同等人［12］對山苦菜組織培養(yǎng)的研究采用的是愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)途徑，這種方法周期較長.本次研究成功地獲得了無芽嫩莖的直接分化芽，建立了山苦菜的無性系.誘導(dǎo)直接分化不僅操作簡單、節(jié)省成本，而且繁殖速度要比以往愈傷再分化的速度快得多，提升了山苦菜快速繁殖的效率，能夠更有效地解決各方面對山苦菜種苗的需求.本研究培養(yǎng)的山苦菜試管苗不僅可為栽培提供較理想的試管苗，而且也為山苦菜野生資源得到保護(hù)、轉(zhuǎn)基因研究和基因庫的建立奠定了基礎(chǔ).

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Clone construction through direct differentiation from tender stems ofIxerischinensis

ZHANG Zhuo，WANG Yan，WANG Xiao－xu，LI Hui，JIANG Chang－yang
（College of Life Sciences，Liaoning Normal University，Dalian 116081，China）

In order to preserve the wild resources and meet the needs of germchits for planting，meristems，leaves，stipe and tender stems without buds ofIxerischinensiswere used as explants to induce direct differentiation.The results indicated that tender stems without buds were the best one of the four stuffs for direct differentiation inducing without callus，MS＋BA 0.5 mg／L＋I(xiàn)BA 0.5 mg／L＋KT 0.5 mg／L＋sucrose 30 g／L was the perfect medium for direct differentiation induction；the best medium for rooting of differentiated buds was 1／4 MS＋I(xiàn)AA 0.2 mg／L＋sucrose 20 g／L；1／2 clays from garden＋1／2 sands was the best substrate for transplanting of regeneration plants，the transplanting survival rate was 98.4%and stable planting survival rate was 98.8%.This experiment proved that clone through direct differentiation from tender stems ofIxerischinensiscan be established with perfect conditions.

Ixerischinensis；direct differentiation；rooting；clone

Q945

A

1000－1565（2012）02－0180－07

2011－09－16

遼寧省高等教育教學(xué)改革項(xiàng)目（20090304）；遼寧師范大學(xué)教學(xué)改革項(xiàng)目（LSJG：20090108）

張卓（1987－），女，遼寧沈陽人，遼寧師范大學(xué)在讀碩士研究生.

姜長陽（1953－），男，遼寧大連人，遼寧師范大學(xué)教授，主要從事植物技術(shù)研究.E－mail：changyangjiang＠126.com

趙藏賞）