廢棄蓖麻基潤滑油高效降解菌的分離與鑒定

劉亞瓊，王昌祿，李風娟，葉 峰

(1. 食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2. 南開大學蓖麻工程研究中心，天津 300071)

隨著人類環保意識的提高，人們已開始關注潤滑油可能造成的環境污染．石油的開采、運輸、加工、儲藏等人為活動的進行，使得石油及石油產品成為土壤有機污染的重要因素．在油井附近，石油類污染物含量平均達到 15.8,g/kg，而農田中的含量僅為 2.2,mg/kg[1]，全世界每年約有10億噸石油及其產品通過各種途徑進入地下水、地表水及土壤中[2–3]．隨著全球潤滑油消耗量逐漸增加，對環境的污染日趨加劇，污染物嚴重影響人類及其他生物的生存健康[4–5].目前，大多數研究通過添加 N、P[6]等營養物質改善土著微生物的活性，但受環境影響，土著微生物生長緩慢，使環境修復受到一定限制．向環境中投加適應強、降解效能高的菌種或菌群是提高石油污染土壤生物修復效率的主要手段[7–9]，開發可生物降解潤滑油并對潤滑油進行生物降解可行性評價已經成為潤滑油行業發展的必然趨勢[10]．

蓖麻基潤滑油是以蓖麻油為主要原料合成的一種新型潤滑油，在使用過程中是否可生物降解以及對環境造成污染的程度是企業關注的熱點．目前，國際上已建立了多種有機物生物降解性的測定方法[11–15]，如通過檢測 CO2的生成量來評價其生物降解能力的STURM 法[12]；以 BOD5/CODCr為度量指標，檢測生物降解過程中 O2消耗量的 MITI法[12]；以生物降解前后油品含量的變化為其度量指標的 CEC-L-33-A-93法[13–14]以及其他實驗方法[15]．在借鑒這些常用生物降解方法的基礎上，本文采用氣相色譜法(GC)，通過添加內標物，定量分析廢棄蓖麻基潤滑油的殘余量，計算廢棄蓖麻基潤滑油的降解率，既而從蓖麻榨油車間排污口處分離到對廢棄蓖麻基潤滑油具有降解特性的菌株．

1 材料與方法

1.1 樣品來源及培養基

從內蒙古某蓖麻榨油車間排污口采取土樣和水樣；廢棄蓖麻基潤滑油由南開大學蓖麻工程研究中心提供．

礦物降解培養基：KH2PO43.4,g，Na2HPO41.5,g，(NH4)2SO44.0,g，MgSO40.7,g，NaCl 1.6,g，酵母粉0.01,g，吐溫 80 0.6,mL，蓖麻基潤滑油 5.0,mL，自來水 1,L，pH 7.0～7.2，121,℃滅菌 20,min．

富集培養基：葡萄糖 3,g，NaCl 5,g，酵母膏 3,g，蛋白胨 3,g，K2HPO4·3H2O 2.7,g，自來水 1,L，pH 7.2，115,℃滅菌 15,min．

麥芽汁培養基：將麥芽粉與水以質量比為 1﹕4混合，在 65,℃水浴鍋中保溫 3～4,h，使其自行糖化，直至糖度為 12,Brix，糖化液用 4～6層紗布過濾，濾液如仍混濁，可用雞蛋清澄清(用 1個雞蛋清，加水20,mL，調勻至生泡沫，倒入糖化液中，攪拌煮沸，再過濾)．

PDA培養基：稱取去皮馬鈴薯200,g，切成小塊，加入 1,L自來水煮沸 30,min，用雙層紗布濾成清液．加水至 1,L，加入 20,g葡萄糖完全溶解，pH 自然．固體培養基加瓊脂20,g．121,℃滅菌15,min．

1.2 降解菌的分離篩選

在無菌條件下，取少量樣品，加入 50,mL無菌水攪拌，制成懸浮液，移取 0.1,mL懸浮液，放入以廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源的篩選培養基平板上，用無菌涂布器連續涂布 4個平板，置于 30,℃恒溫培養箱中培養 2～3,d，挑取生長較快且不同菌落形態的菌株，進一步分離純化復篩．從中篩選出能以廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源生長的菌株．

1.3 培養條件對菌株生長的影響

配制初始 pH 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的 PDA 培養基，滅菌后用無菌水沖洗試管斜面，將沖洗的孢子混勻后按 3%的量加入到不同初始 pH的 PDA培養基中．培養 3,d后觀察菌株生長狀況，過濾后在 80,℃鼓風烘箱中烘干菌絲體至恒質量，稱取菌絲體．同理，在不同培養溫度：15、20、25、30、35、40,℃的培養環境中，180,r/min，培養48,h后，測定不同培養溫度時生物量，確定最適生長溫度．稱取 0.5、1、2、4、6、8、10、12,g 廢棄蓖麻基潤滑油分別加入 100,mL的礦物培養基中，30,℃、培養12,d后觀察各瓶生長情況．

1.4 菌落形態觀察

在麥芽汁和 PDA平板培養基中觀察菌株 M-4的菌落特征，并用電鏡掃描觀察其菌絲體孢子形態，初步確定菌株的分類．

1.5 18S,rDNA基因擴增及序列分析

采用CTAB法提取菌株M-4總DNA，利用真菌18,S rDNA擴增通用引物 F1(GTAGTCATATGC TTGTCTC)和R1(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)進行PCR擴增．25,μL反應體系中含有：10×PCR緩沖液 2.5,μL，50,mmol/L 的 MgCl20.8,μL，10,mmol/L的 dNTP 0.5,μL，引物各 0.5,μL，5,U/μL 的 Taq DNA聚合酶 0.2,μL，模板 DNA 1,μL，加無菌雙蒸水補至25,μL．PCR 反應條件為：94,℃變性 5,min，55,℃退火30,s，72,℃延伸 1,min，30個循環后 72,℃溫育10,min，4,℃保存備用．擴增產物通過 1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在凝膠成像儀上觀察并記錄結果，得到條帶清晰的片段后進行切膠，用Axygen 凝膠回收試劑盒對PCR產物進行回收純化．

擴增后的 18S rDNA純化后由英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序，測得的序列提交到GenBank并在國際生物技術信息網中心(NCBI)數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行序列同源性分析，使用Clustal X1.8軟件與從GenBank數據庫中獲得的18S rDNA序列進行多序列比較，Mega 4.0軟件中NJ法(鄰接法)構建16S rDNA系統發育樹，bootstrap檢驗，重復1,000次，確定該菌株的分類．

1.6 標準曲線的繪制

分別稱取 10.0、30.0、50.0、70.0、90.0,mg 的廢棄蓖麻基潤滑油基礎油及 50.0,mg聯苯置于 10,mL容量瓶中，用聯苯作內標物，乙酸乙酯作溶劑．萃取物用GC進行分析：采用火焰離子化檢測器(FID)，Rtx-5 的二氧化硅柱．分析條件：初始溫度為 50,℃，保持5,min，然后以20,℃/min 升溫至 280,℃，保持 40,min．進樣器和檢測器的溫度都維持在 280,℃，進樣 1,μL，用氮氣作載氣．以聯苯與基礎油的質量比為橫坐標，面積比為縱坐標繪制標準曲線．

1.7 廢棄蓖麻基潤滑油基礎油降解實驗

將菌株 M-4活化后進行廢棄蓖麻基潤滑油基礎油的生物降解，從種子培養基中吸取 1,mL種子液，接種到已滅菌的含廢棄蓖麻基潤滑油基礎油的錐形瓶中，準確稱取每瓶加入的廢棄蓖麻基潤滑油基礎油，30,℃、180,r/min遮光振蕩培養 7,d，取出培養液，10 000,r/min離心10,min，取上清液，加入1,mol/L的HCl約 1,mL和 NaCl 20,g，振蕩，待 NaCl完全溶解后，采用超聲波細胞破碎儀將培養基中的微生物細胞壁破碎，使內容物釋放及進一步破乳．用乙酸乙酯作萃取劑萃取3次，每次用量30,mL，劇振2,min，靜置分層，收集萃取液上層有機相，放入三角瓶中，在萃取后90,mL的萃取液中加入500,mg聯苯，作為內標物．按照1.6的條件進行GC分析．

式中：m基剩為剩余基礎油的質量；m聯苯為聯苯的質量；m基為基礎油的質量；A聯苯為聯苯的峰面積；A基剩為剩余基礎油的峰面積；w為降解率．

2 結果與分析

2.1 高效降解菌的篩選

從內蒙某蓖麻榨油廠排污口采取土樣和水樣，經富集培養及分離純化，篩選出 25株菌株，經過潤滑油降解實驗誘導馴化后選取能在廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源培養基上生長較好的菌株M-4．

2.2 菌落形態觀察

菌株 M-4的菌落特征如圖 1所示，菌絲體孢子形態見圖2．

由圖 1和圖 2可以看出，在麥芽汁培養基上，30,℃培養 4,d，菌株 M-4的菌落直徑達 20,mm，表面毛絨狀，菌絲致密交錯，分生孢子梗先白色然后四周開始變成褐色，而 PDA培養基的生長狀態基本與麥芽汁培養基上生長狀態一致．

圖1 菌株M-4菌落形態Fig. 1 Colonial morphology of M-4 strain

圖2 菌株M-4電鏡掃描圖Fig. 2 Scanning map of M-4 strain under electron microscope

2.3 菌株M-4的18S rDNA序列分析

以菌株 M-4提取的 DNA為模板，擴增其 18S rDNA基因序列，得到長約1,500,bp的18S rDNA片段，如圖 3所示．擴增片段經測序后，測得其長度為1,675,bp，其 GenBank 序列號為 HM165489.1．

圖3 菌株M-4的18S rDNA片段擴增電泳圖譜Fig. 3 18S rDNA fragments amplified by electrophoresis of M-4 strain

2.4 系統進化樹分析

將菌株M-4的基因序列提交至GenBank數據庫并進行 Blast比對，其序列與鏈格孢屬(Alternaria alternata)同源性達99%，選取11株同源性較高的菌株序列進行比對，構建系統發育樹，如圖4所示．由18S rDNA基因序列比對可知，菌株 M-4與 Alternaria alternata親緣關系最接近，結合菌落形態觀察，菌株M-4鑒定為鏈格孢屬(Alternaria alternata)．

圖4 菌株M-4 18S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree constructed by18S rDNA gene sequence of M-4 strain

2.5 培養條件對菌株生長的影響

2.5.1 最適pH

在其他條件一致的情況下，培養基的初始 pH對菌株 M-4的生長有較大影響．在不同 pH下，菌株M-4生長狀態、菌絲體形狀、發酵產物顏色等都不同．觀察發現，pH 2和pH 10的培養瓶都不生長；pH 3的生長較慢，呈小球狀；pH 9的培養基呈渾濁狀態，菌絲體呈小球狀；其余 pH條件下的菌株生長液呈黑色黏稠狀；pH 5、pH 7的顏色較深；pH 6的培養基中菌體呈團，培養液澄清．將培養3,d不同初始pH的菌株 M-4進行過濾烘干至恒質量后稱取菌體，初始pH對菌株M-4生長的影響如圖5所示．菌株M-4在酸、堿性條件下都能適應并生長，最適pH為5.0．

圖5 初始pH對菌株M-4生長的影響Fig. 5 Effect of initial pH on the growth of M-4 strain

2.5.2 最適溫度

隨著溫度的上升，細胞中的生化反應速率和生長速率加快；另一方面，機體的重要組成如蛋白質、核酸和催化反應的酶等對溫度都很敏感，隨著溫度的增高可能受到不同程度的破壞．因此，選擇合適的溫度對菌株性能至關重要．溫度還影響酶活力，在適宜溫度下，產酶量增加，酶的活力提高，菌株降解能力增強[16]．

培養溫度對菌株 M-4生長的影響如圖 6所示．從圖 6可以看出，菌株 M-4在 30,℃時生物量最高．

圖6 溫度對菌株M-4生長的影響Fig. 6 Effect of temperature on the growth of M-4 strain

2.5.3 潤滑油極限含量

潤滑油降解過程中主要依靠微生物對底物的一系列復雜的生化反應過程來達到降解目的．圖7為菌株 M-4在不同潤滑油含量的培養基中降解 7,d后的生長情況．

圖7 菌株 M-4在不同廢棄蓖麻基潤滑油含量的培養基中的生長情況Fig. 7 Growth condition of M-4 strain at different concentrations of waste castor-based lubricants

從圖 7可以看出，菌株 M-4在含廢棄蓖麻基潤滑油12%的礦物培養基中生長良好，將廢棄蓖麻基潤滑油直接降解變成黏稠的泥狀．表明該菌株在富含廢棄蓖麻基潤滑油的環境中生長旺盛，可為實際生態修復提供參考．

2.6 標準曲線的繪制

按1.6方法繪制廢棄蓖麻基潤滑油基礎油標準曲線(圖 8)，求出線性回歸方程 y＝1.477,4x＋0.185,2，相關系數 R2＝0.999,4．以聯苯與基礎油的質量比為橫坐標，面積比為縱坐標繪制標準曲線．

圖8 蓖麻基潤滑油基礎油標準曲線Fig. 8 Standard curve of base oil of castor-based lubricants

2.7 廢棄蓖麻基潤滑油基礎油降解后GC分析

根據廢棄蓖麻基潤滑油基礎油標準曲線和內標物(聯苯)計算廢棄蓖麻基潤滑油基礎油殘余量．

廢棄蓖麻基潤滑油基礎油降解后萃取的有機相用 GC進行分析(圖 9)，樣品中只檢測到溶劑峰，聯苯峰和廢棄蓖麻基潤滑油基礎油峰，分別出現在保留時間為 3、12、21,min處．根據聯苯的質量和峰面積計算殘余廢棄蓖麻基潤滑油基礎油和降解的廢棄蓖麻基潤滑油基礎油質量，結果見表1．

圖9 菌株M-4降解廢棄蓖麻基潤滑油基礎油的GC圖Fig. 9 GC map of the base oil of waste castor-based lubricants after degradation by M-4 strain

表1 菌株M-4對廢棄蓖麻基潤滑油基礎油的降解情況Tab.1 Degradation rate of the base oil of waste castor-based lubricants

從表1可以看出，菌株M-4對廢棄蓖麻基潤滑油基礎油降解率為71.3%．

3 結 論

利用廢棄蓖麻基潤滑油為唯一碳源的礦物培養基，采用平板梯度連續涂布法，從內蒙古蓖麻榨油車間排污口分離篩選到一株高效降解菌M-4，通過對該菌株生理生化特性、18S rDNA基因擴增及系統進化樹分析，菌株M-4鑒定為鏈格孢屬．

此外，對菌株M-4培養特性的研究表明，在不同初始pH和培養溫度下，菌株M-4生長狀況不同，影響較大．在其他條件一致時，廢棄蓖麻基潤滑油含量不同，菌株M-4的生長情況不同，在含廢棄蓖麻基潤滑油 12%的礦物培養基中，菌株仍能較好地生長，將廢棄蓖麻基潤滑油直接降解變成黏稠多孔的泥狀，為生態環境的實地修復提供了參考．

在廢棄蓖麻基潤滑油基礎油中加入 M-4菌液培養7,d后，降解率達到71.3%．采用GC方法，檢測廢棄蓖麻基潤滑油基礎油的降解產物，未出現其他中間代謝產物，表明廢棄蓖麻基潤滑油的基礎油主要成分更容易被微生物降解．

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