靛玉紅甲肟對食管癌EC9706細胞增殖、凋亡的影響*

劉曉莉，劉懷民 ，高啟龍，陳小兵，張成娟，楊 峰

1)河南省腫瘤醫院中西醫結合科鄭州450008 2)河南省腫瘤醫院腫瘤內科鄭州450008 3)河南省腫瘤醫院病理科鄭州450008#通訊作者，男，1970年3月生，博士，副主任醫師，研究方向:消化道腫瘤的中西醫結合治療，E-mail:lhm1970311@126.com

食管癌是消化系統常見惡性腫瘤，以手術為主的綜合治療是其主要治療手段; 但食管癌化療的效果并不理想，復發轉移率較高。靛玉紅是傳統中成藥當歸龍薈丸中青黛的抗腫瘤有效成分，其衍生物靛玉紅甲肟(分子式為C16H11N3O2，相對分子質量為277.3)是具有新型結構的抗腫瘤藥。靛玉紅及其衍生物可抑制人體多種腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞周期阻滯，促進腫瘤細胞凋亡［1］。作者的前期研究［2］發現靛玉紅甲肟可抑制食管癌EC-1 和Kyse70 細胞增殖，但具體分子機制尚不完全明確。該研究觀察了靛玉紅甲肟對人食管癌EC9706 細胞體外增殖和凋亡的影響，初步探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 靛玉紅甲肟購自美國Sigma 公司，取5 mg 溶于1 mL 二甲基亞砜(DMSO)中，配成18 mmol/L 的母液，過濾除菌備用。甲基噻唑藍(MTT)及DMSO、胎牛血清、RPMI 1640 培養液。EC9706 細胞系購自上海細胞庫。

1.2 細胞培養 EC9706 細胞用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液(含青霉素、鏈霉素各100 U/mL)，在37℃、體積分數5% CO2及飽和濕度條件下培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞增殖抑制率檢測 用2.5 g/L 胰蛋白酶消化對數生長期細胞，加入含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液，調整細胞濃度為2×104mL－1，接種于96 孔培養板中。培養24 h，貼壁后棄去上清，分別加入濃度為0、1、5 及10 μmol/L 的靛玉紅甲肟，每組5 個復孔; 繼續培養12、24 及48 h后，MTT 法測增殖抑制率，檢測波長為570 nm。測定各孔吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率=(對照組A 值－實驗組A 值)/對照組A 值×100%。

1.4 細胞凋亡檢測 EC9706 細胞用10 μmol/L 靛玉紅甲肟作用0、24、48、72 h 后，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化收集，吹打制備單細胞懸液，保證每管細胞數至少達1×106個。將100 μL 細胞懸液加入5 mL培養管中，加入Annexin V-FITC 和活細胞染料PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS，1 h 內上流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.5 Sox-2 mRNA 檢測 分別用濃度為0、1、5 及10 μmol/L 的靛玉紅甲肟作用于EC9706 細胞48 h后，收集各組細胞，利用RNeasy Mini 試劑盒提取細胞RNA 并純化，用一步法RT-PCR 試劑盒對提取的RNA 進行逆轉錄，上PCR 機擴增，瓊脂糖凝膠電泳后，采用Gel Doc 2000TM凝膠圖像分析儀采集圖片，用Quantity One 軟件對條帶灰度值進行分析。Sox-2上游引物序列5’-TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA-3’，下游引物序列5’-CTGGGGCTCAAACTTCTCTC-3’，產物長度為76 bp。內參β-actin 上游引物序列5’-CAACGCGAACCGCGAGAAGATG-3’，下游引物序列5’-GTCGAGGGCGACGTAGCAGAGG-3’，產物長度為330 bp。操作按試劑盒說明書進行。以目的條帶與β-actin 條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA 的相對表達量。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0 數據處理，采用4×3 析因設計的方差分析對細胞增殖抑制率進行分析，采用單因素方差分析對各組細胞凋亡率和Sox-2 mRNA 的相對表達量進行比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 靛玉紅甲肟對EC9706 細胞增殖的影響 增殖抑制率測定結果見表1。由表1可以看出，隨著靛玉紅甲肟濃度的增大和作用時間的延長，EC9706 細胞的增殖抑制率也逐漸增加，呈劑量和時間依賴性。

表1 各組EC9706 細胞增殖抑制率測定結果(n=5)%

2.2 靛玉紅甲肟對EC9706 細胞凋亡的影響 經10 μmol/L 靛玉紅甲肟作用后，隨作用時間延長，細胞凋亡率逐漸增加，0、24、48 和72 h 的凋亡率分別為(2.7±1.5)%、(10.4±1.3)%、(19.1±1.4)%和(29.3± 2.6)%，差異有統計學意義(F =195.350，P ＜0.001)。

2.3 靛玉紅甲肟對EC9706 細胞Sox-2 mRNA 表達的影響 RT-PCR 結果見圖1。0、1、5 和10 μmol/L 靛玉紅甲肟作用48 h 后，EC9706 細胞Sox-2 mRNA 的相對表達量分別為(0.974± 0.059)、(0.720±0.042)、(0.657± 0.074)和(0.401±0.039)，逐漸下降(F=87.552，P ＜0.001)。

圖1 靛玉紅甲肟作用后EC9706 細胞Sox-2 mRNA 的表達

3 討論

靛玉紅作為抗腫瘤的有效成分已應用多年，有研究［2-3］表明，靛玉紅可抑制多種腫瘤細胞的體外增殖，還可增加其他抗癌藥物對耐藥細胞的細胞毒性作用，臨床療效可靠，對骨髓無明顯抑制作用。目前其衍生物靛玉紅甲肟的抗腫瘤作用越來越受到重視。

食管癌是消化系統常見惡性腫瘤，其復發轉移及化療耐藥是總體生存率不高的主要原因。在對食管癌EC-1 細胞體外生長干預實驗中，研究者［2］發現靛玉紅甲肟與奈達鉑聯用可以增強對EC-1 細胞的殺傷作用。該實驗結果顯示，隨著靛玉紅甲肟濃度的增加和作用時間的延長，EC9706 細胞的增殖抑制率也逐漸增大; 靛玉紅甲肟作用后EC9706 細胞的凋亡率也逐漸增大，并呈時間依賴性;提示靛玉紅甲肟體外能抑制EC9706 細胞的增殖，并可有效誘導其凋亡。

Sox 家族參與胚胎發育的轉錄調控，決定細胞的歸宿，對多種組織器官的發育具有重要作用，并參與人類性別的決定［4］。在胚胎干細胞(ES 細胞)中，Sox-2 呈高度表達狀態，它標志著ES 細胞和腫瘤干細胞(TS 細胞)具有保持未分化的全能性［5］，Sox-2 轉錄水平在一定程度上決定著ES 和TS 細胞的分化方向和自我更新能力［6］。在某些疾病中，Sox基因被發現可能直接參與或協助癌癥的發生［7-8］。Li 等［9］認為Sox-2 蛋白的過量表達與胃癌的發生有關。作者的前期研究［10］發現，靛玉紅甲肟能抑制膀胱癌細胞的增殖并可降低其Sox-2 的表達，且具有時間和劑量依賴性。該研究結果顯示，靛玉紅甲肟濃度從1 μmol/L 升至10 μmol/L 時，EC9706 細胞Sox-2 mRNA 的相對表達量逐漸降低，表明靛玉紅甲肟可抑制EC9706 細胞中Sox-2 mRNA 的表達，該作用具有量效關系。由此推斷，抑制Sox-2 的轉錄可能是靛玉紅甲肟抑制EC9706 細胞增殖和誘導凋亡的作用機制之一。

綜上所述，靛玉紅甲肟對食管癌EC9706 細胞具有明顯的增殖抑制和誘導凋亡作用，其作用機制可能與下調Sox-2 mRNA 的表達有關，但其具體作用途徑和分子機制尚需進一步研究。目前，常規化療對TS 細胞作用微弱。靛玉紅甲肟能抑制TS 細胞中Sox-2 等轉錄因子表達這一特性，可能為特異性殺滅TS 細胞提供了一條新的思路。

［1］吳琦瑋，葛忠良，高月，等.靛玉紅對腫瘤細胞抑制作用的研究及相關機制探討［J］.天津中醫藥，2008，25(1):55

［2］陳小兵，張軍輝，羅素霞，等.靛玉紅甲肟對奈達鉑抗人食管癌EC-1 細胞的化療增效作用［J］.腫瘤防治研究，2009，36(11):914

［3］Shi J，Shen HM.Critical role of Bid and Bax in indirubin-3’-monoxime-induced apoptosis in human cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，75(9):1729

［4］Niwa H，Miyazaki J，Smith AG.Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation，dedifferentiation or self-renewal of ES cells［J］.Nat Genet，2000，24(4):372

［5］Carlin R，Davis D，Weiss M，et al.Expression of early transcription factors Oct4，Sox-2 and Nanog by porcine umbilical cord (PUC)matrix cells［J］.Reprod Biol Endocrinol，2006，4:8

［6］袁虎，王秋菊，韓東一.SOX 家族基因的功能及其研究進展［M］.國外醫學:遺傳學分冊，2005，28(6):332

［7］Katoh M.Expression of human SOX7 in normal tissues and tumors［J］.Int J Mol Med，2002，9(4):363

［8］Xia Y，Papalopulu N，Vogt PK，et al.The oncogenic potential of the high mobility group Box protein Sox3［J］.Cancer Research，2000，60(22):6303

［9］Li XL，Eishi Y，Bai YQ，et al.Expression of the SRY-related HMG box protein SOX2 in human gastric carcinoma［J］.Int J Oncol，2004，24(2):257

［10］劉曉莉，樊青霞，曹婧，等.靛玉紅甲肟對膀胱癌T24 細胞系體外生長抑制的研究［J］.山東醫藥，2008，48(27):62