肺癌組織中Nrf2、Keap1和NQO1蛋白的表達*

倪 靜，秦麗娟，吳擁軍 ，王 靜，吳逸明

1)鄭州大學公共衛生學院衛生毒理學教研室 鄭州450001 2)鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科 鄭州450052#通訊作者，男，1968年1月生，博士，教授，研究方向:生化與分子毒理，E-mail:wuyongjun@zzu.edu.cn

肺癌是我國發病率非常高的一種惡性腫瘤，其發生發展是一個多基因、多階段的過程，是環境和遺傳因素共同作用的結果［1］。從功能角度看，肺癌屬蛋白組性疾病。Nrf2 是細胞調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子，Keap1 是Nrf2 的關鍵調節因子［2］。抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)存在于大鼠/小鼠GST A2 亞基、大鼠/人NQO1、r-GCS 等和Ⅱ相代謝酶基因啟動子5’調控區，其具有保守序列5’-(G/A)TGA(G/C)nnnGC(G/A)-3’，在Ⅱ相解毒酶的調控中起重要作用。Keap1-Nrf2 系統在細胞抵御外源性或內源性氧化應激的機制中占有重要地位。研究［3-6］顯示，Nrf2 對腫瘤細胞有保護作用，可降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，誘導耐藥的產生，Nrf2 缺失和激活障礙與化合物致癌、藥物性肝損傷、炎癥修復延遲、細胞凋亡等病變過程相關［7］。隨著對Keap1-Nrf2 在細胞應激保護、損傷修復等諸多方面認識的深入及作用機制的了解，Keap1-Nrf2 將為抗腫瘤、抗炎癥治療提供新的思路。國內外對于該通路的機制研究尚不充分，為此，作者擬通過檢測肺癌組織Keap1-Nrf2/ARE 通路中各蛋白的表達情況，為肺癌發生機制的研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 標本來源 在知情同意的情況下，選擇鄭州大學第一附屬醫院胸外科住院的肺癌手術患者67例，其中男35例，女32例，年齡30～78(54.9±5.2)歲。肺鱗癌29例，肺腺癌38例;高分化21例，中分化29例，低分化17例。同時選取同例患者癌旁5 cm 的肺組織作為正常對照，癌及癌旁正常組織均經病理學確診。

1.2 主要儀器與試劑 冷凍切片機(LEICA CM3050S，德國)，兔抗人多克隆一抗(北京博奧森生物技術有限公司)，SP-9001 型免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 肺組織中Keap1、Nrf2、NQO1 蛋白表達的檢測 采用免疫組化法。取手術切除的肺組織標本，體積分數10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm 厚切片，一抗按1∶ 100 稀釋，按照SP-9001 型免疫組化試劑盒說明書進行操作。應用江蘇捷達科技公司圖像采集分析系統，在高倍顯微鏡視野下，每張切片選取陽性細胞集中的視野采集6～10 個圖像，利用Image-Pro Plus 6.0 軟件對每張圖片處理后計算其平均光密度。

1.4 統計學處理 采用SPSS 12.0 處理數據，癌及癌旁組織Keap1、Nrf2 及NQO1 表達水平的比較應用配對樣本t 檢驗，臨床病理特征中腫瘤體積、分化程度及臨床分期采用單因素方差分析，其他均采用兩獨立樣本t 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 肺癌及癌旁正常組織中Keap1、Nrf2、NQO1蛋白的表達 與癌旁正常組織比較，肺癌組織中Keap1 蛋白多見于細胞質和細胞核中，呈淡黃色或棕褐色顆粒;Nrf2 蛋白呈淡黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細胞核中，散見于細胞質中;NQO1 蛋白在細胞質與細胞核中均有不同程度的表達，呈棕褐色顆粒。見圖1。

2.2 肺組織中Keap1、Nrf2 及NQO1 蛋白表達情況 見表1。

圖1 正常肺組織(A)與肺癌組織(B)中Keap1、Nrf2、NQO1 蛋白免疫組化檢測(SP，×100)

2.3 Keap1、Nrf2 和NQO1 蛋白的表達與肺癌臨 床病理特征的關系 見表2。

表1 肺組織中Keap1、Nrf2、NQO1 蛋白表達情況

表2 Keap1、Nrf2 和NQO1 蛋白的表達與肺癌臨床病理特征的關系

3 討論

Nrf2 核轉錄因子是細胞保護因子，正常生理狀態下與胞質蛋白伴侶分子Keap1 結合，其活性處于相對抑制狀態。氧化應激條件下，Nrf2 逃脫Keap1的結合抑制，進入細胞核，與ARE 結合，啟動ARE調控下游基因的表達，其中包括NQO1。

Padmanabhan 等［8］發現人肺癌細胞株中Keap1的DGR 結構域甘氨酸轉變為半胱氨酸，引起構象的改變，導致Nrf2 核內聚集。Singh 等［9］通過對肺癌患者樣本和肺癌細胞株中Keap1 基因位點的系統分析，發現Keap1 主要功能區序列出現缺失、插入和錯義等基因突變，導致Keap1 功能失活以及Nrf2 的釋放，相應地激活了癌組織細胞中Nrf2 介導的基因表達。另外，Nrf2 中Keap1 的結合序列DLG 和ETGE基序中任何一個位點氨基酸密碼子發生置換，Keap1對Nrf2 基因的負調控作用都會消失［10］。該研究發現肺癌組織中Keap1 蛋白在各臨床分期的表達水平除Ⅱ期腺癌外均明顯高于正常組織，推測可能是由于Keap1 發生突變使其功能受損，導致Keap1 不能與Nrf2 相互作用，使Keap1 表達升高; Nrf2 蛋白除Ⅰ期腺癌略高于正常組織外，其他均低于正常組織，與上述文獻不同，另外NQO1 蛋白除Ⅱ期腺癌略高于正常組織外，其他也均低于正常組織，推測可能存在其他通路的作用降低了Nrf2 及其調控基因NQO1的表達。同時這3 種蛋白的表達水平與肺癌的臨床分期和病理組織學分型有關，提示Keap1-Nrf2/ARE通路在肺癌的發生發展過程中發揮重要的作用。

另有研究［11］發現Keap1 和Nrf2 突變后導致肺癌發生率完全不同，前者在腺癌中常見，后者在鱗癌中常見。存在Nrf2 突變的癌癥患者有以下幾個特點:①吸煙史發生率較高。②鱗癌發生率較高。該研究結果顯示肺癌患者吸煙Keap1 蛋白的表達水平要高于不吸煙者，與上述文獻一致，但Keap1 蛋白在各期鱗癌中表達水平要高于腺癌，Nrf2 蛋白僅在Ⅱ期和Ⅲ期鱗癌中表達高于腺癌，推測Keap1、Nrf2 蛋白的異常表達與肺癌的發生發展有關。

［1］周舫，梁守沛，王玉珍，等.肺癌組織中HSP70-1 +190(G/C)多態性對HSP70-1 mRNA 及HSP70 蛋白表達的影響［J］.鄭州大學學報:醫學版，2011，46(4):514

［2］Lau A，Villeneuve NF，Sun Z，et al.Dual roles of Nrf2 in cancer［J］.Pharmacol Res，2008，58(5/6):262

［3］Wang XJ，Sun Z，Villeneuve NF，et al.Nrf2 enhances resistance of cancer cells to chemotherapeutic drugs，the dark side of Nrf2［J］.Carcinogenesis，2008，29(6):1235

［4］Kim HR，Kim S，Kim EJ，et al.Suppression of Nrf2-driven heme oxygenase-1 enhances the chemosensitivity of lung cancer A549 cells toward cisplatin［J］.Lung Cancer，2008，60(1):47

［5］Kim SK，Yang JW，Kim MR，et al.Increased expression of Nrf2/ARE-dependent anti-oxidant proteins in tamoxifen-resistant breast cancer cells［J］.Free Radic Biol Med，2008，45(4):537

［6］催俁，馬海英，孔力.Nrf2/ARE 通路與機體抗氧化機制的研究進展［J］.吉林大學學報:醫學版，2011，37(1):187

［7］Taguchi K，Motohashi H，Yamamoto M.Molecular mechanisms of the Keap1-Nrf2 pathway in stress response and cancer evolution［J］.Genes Cells，2011，16:123

［8］Padmanabhan B，Tong KI，Ohta T，et al.Structural basis for defects of Keap1 activity provoked by its point mutations in lung cancer［J］.Mol Cell，2006，21(5):689

［9］Singh A，Misra V，Thimmulappa RK，et al.Dysfunctional KEAP1-NRF2 interaction in non-small-cell lung cancer［J］.PLoS Med，2006，3(10):e420

［10］Hayes JD，McMahon M.NRF2 and KEAP1 mutations:permanent activation of an adaptive response in cancer［J］.Trends Biochem Sci，2009，34(4):176

［11］Shibata T，Ohta T，Tong KI，et al.Cancer related mutations in NRF2 impair its recognition by Keap1-Cul3 E3 ligase and promote malignancy［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(36):13568