河南漢族動脈硬化性腦梗死人群血小板膜糖蛋白Iba基因VNTR多態性檢測*

李 濤，尚迎輝，白峻瑜，石聰聰，封青川，賀 穎，鄭 紅

1)鄭州大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學教研室 鄭州450001 2)鄭州市市直機關醫院內科 鄭州450007#通訊作者，女，1966年3月生，博士，教授，研究方向:遺傳性疾病致病基因的篩選，E-mail:hzheng@zzu.edu.cn

血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib-IX 復合物是血小板膜的主要糖蛋白之一，在血小板表面形成血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)的受體，參與血小板黏附于受損血管壁的反應，其亞單位GPIba 基因多態性能夠改變GPIb-IX-V 的抗原性，調節其結構和表達水平，影響血小板的黏附、聚集和活化反應，參與動脈粥樣硬化的發生、血栓栓塞的形成和血管痙攣等各個環節，與心腦血管疾病的發生密切相關［1］。其中GPIba 編碼巨球肽區域39個堿基的可變數目串聯重復序列(variable number of tandem repeats，VNTR)數目的改變可致多肽鏈上399 位絲氨酸殘基到411 位蘇氨酸殘基的改變，從而影響蛋白質的功能。目前關于血小板GPIba 基因VNTR 長度多態性與動脈硬化性腦梗死(atherothrombotic brain infarction，ABI)關系的研究［2-4］結論尚不一致。作者應用PCR 法對河南漢族434例ABI患者和500例健康對照進行GPIba 基因VNTR 長度多態性檢測，探討GPIba 基因VNTR 多態性與ABI的關系，為ABI 的防治提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 遵循知情同意原則，隨機選取2004年12月至2006年6月河南省二甲以上醫院神經內科住院的ABI 患者434例(病例組)，均經臨床檢查(病史、體征、生化檢驗、CT 或MRI)確診。434例中男280例，女154例，年齡28～88(62.2±12.2)歲。正常對照選自同期健康體檢的隨機個體500 人(對照組)，其中男305 人，女195 人，年齡21～89(62.6±12.2)歲。該研究個體間無血緣關系，均為河南漢族人群。排除患有心、腦血管疾病及肝、腎、內分泌疾病者。

1.2 GPIba 基因VNTR 多態性檢測 抽取上述研究對象清晨空腹外周靜脈血3 mL，EDTA 抗凝，用常規酚/氯仿法提取基因組DNA，其含量用紫外分光光度計測定。VNTR 引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物序列5’-CACTACTGAAC CAACCCCAAG-3’，下游引物序列5’-TTGTG GCAGACSCCAGGATGG-3’，擴增產物大小為195～312 bp。PCR 擴增體系:模板DNA 2 μL，STR 10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各6 μL，Taq DNA 聚合酶0.3 μL，純水補至25 μL。PCR 擴增條件:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，63℃復性45 s，72℃延伸45 s，循環40 次;72℃延伸5 min。25 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，凝膠成像儀上觀察并照相。由于GPIba 基因VNTR 多態性可產生4種等位基因類型，即A:312 bp 基因片段，含有4 個重復序列;B:273 bp 基因片段，含有3 個重復序列;C:234 bp 基因片段，含有2 個重復序列;D:195 bp 基因片段，含有1 個重復序列。因此，理論上可產生AA、BB、CC、DD、AB、AC、AD、BC、BD 及CD 共10 種基因型。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0 處理數據。應用χ2檢驗比較2組間VNTR 基因型頻率的差異;計算比數比(OR)及95%CI。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 GPIba 基因VNTR 多態分型 見圖1。該研究中病例組未發現BB 和AB 基因型，對照組未發現AA、BB 和AB 基因型。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗 對照組各基因型頻率的分布均符合Hardy-weinberg 平衡(χ2=2.887，P=0.089)，說明該樣本具有良好的人群代表性。

2.3 2組GPIba VNTR 各基因型及等位基因頻率比較 見表1、2。

2.4 河南漢族人群與其他地區人群GPIba 基因VNTR 等位基因頻率的比較 見表3。

表2 ABI組和對照組GPIba的VNTR 各等位基因頻率的分布例(%)

表3 河南漢族人群VNTR 等位基因頻率與其他地區人群相應各等位基因分布頻率比較

3 討論

GPIb-IX 復合物是血小板膜的主要糖蛋白之一。GPIb 相對分子質量約為165 000，有2 個亞單位，即GPIba 和GPIbb。GPIba 含有凝血酶高親和力的結合位點，可在低凝血酶濃度時激活血小板，進而影響血小板的黏附、聚集和活化反應過程，促進血栓形成［11］。

GPIba 基因位于17 號染色體短臂，具有高度多態性。第一個被確定的多態性即VNTR。隨著VNTR 重復序列次數的增加可使vWF 與凝血酶在GPIba 的結合位點延伸到細胞膜外，遠離血小板膜。這種結構變化的潛在影響是將靶分子暴露于更大的剪切力之下，導致剪切力誘導的vWF 和GPIba 相互作用的閾值降低。此外，與vWF 的有效結合需要至少包含2 條GPIba 多態的超復合體，雜合子含兩種等位基因長度不對稱可能影響GPIba 與配體結合［12］。因此，趙宇等［13］認為，如果GPIba 基因VNTR 多態性與血栓性疾病的發生相關，應該是VNTR 含重復序列較多的等位基因和雜合子基因型。

該研究發現:在河南漢族人群中，病例組GPIba基因CD 基因型頻率和BC 基因型頻率高于對照組，且CD 和BC 基因型個體發生ABI 的風險升高，提示CD 與BC 基因型可能是河南地區漢族人群ABI 發生的易感基因型，尤其是CD 基因型在河南漢族人群的分布更為普遍，這種易感基因型的風險更大;這符合Jilma-Stohlawetz 等［12］關于VNTR 雜合子基因型CD 擁有較低的剪切誘導閾值，導致患病風險增大的假設。該研究還顯示，攜帶B 等位基因的個體發生ABI 的風險增加，與Mikkelsson 等［14］報道B 等位基因是青壯年心肌梗死的危險因素的研究結果一致。此外，該研究還顯示病例組DD 基因型頻率低于對照組，且DD 基因型個體發生ABI 的風險明顯降低，提示VNTR 多態性中DD 基因型與ABI 的發生呈負相關，DD 基因型可能是河南地區ABI 發生的遺傳保護因子。

另外，與中國蒙古族人群、高加索人群、非洲人群和印度人群比較，4 種等位基因頻率差異較大，由此也說明了該VNTR 多態性分布的復雜性。

綜上所述，VNTR 多態性中CD 和BC 雜合基因型可能是河南地區漢族人群ABI 發生的危險因子，而DD 基因型可能是遺傳保護因子。

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