中國獼猴CD4+ CD25+調節性T細胞抑制抗結核分枝桿菌特異性T淋巴細胞免疫反應*

秦 潔，龔光明 ，杜 英，孫石磊，楊 璇，朱 沙，軒小燕，劉萍萍，王 娜，許予明

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內三科 鄭州450052 2)鄭州大學基礎醫學院微生物學與免疫學教研室 鄭州450001

#通訊作者，男，1973年12月生，博士，講師，研究方向:抗感染免疫、干細胞與再生醫學，E-mail:gmgong@zzu.edu.cn

結核病仍然是世界上主要致死性疾病之一［1-2］，近期世界范圍內出現大量致死性多重耐藥菌株。造成防治結核分枝桿菌感染進展緩慢的主要原因是對結核分枝桿菌的致病機制以及人類免疫反應的具體機制尚不十分清楚。闡明卡介苗(BCG)感染引發機體產生的免疫反應機制將非常有利于發現新的防治結核分枝桿菌感染的有效措施［1，3］。作者最近的研 究 發 現［4-7］，CD4+CD25+調 節 性T 淋 巴 細 胞(CD4+CD25+regulatory T cell，Tregs)可 以 抑 制Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞的體外抗原特異性和非特異性擴增，對人類抵抗結核分枝桿菌感染的免疫反應有負調節作用。靈長類動物因為具有和人類非常接近的生物學特征，常被用來作為研究人類感染性疾病的珍貴動物模型［8-10］。作者觀察了中國獼猴抗結核分枝桿菌感染過程中Tregs 對效應性T 淋巴細胞產生的抗結核桿菌特異性免疫反應的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6 只雄性中國獼猴，由美國芝加哥伊利諾伊州立大學生物資源中心提供，3 個月內接受過一次靜脈注射106BCG。年齡3～6 歲，體質量3.1～6.9 kg。動物飼養和實驗方法均經該校動物關懷與使用委員會批準。

1.2 主要抗體、試劑和儀器設備 純化鼠抗人CD28、CD3 及PE-Cy7 和PB 融合的CD3 抗體為BD Pharmingen 公司產品，PB 融合的鼠抗人CD4、PECy7 融合的CD8 為eBioscience 公司產品，純化或FITC 融合的TCR Vγ2 抗體、純化或FITC 融合的TCR Vδ2 抗體購自Endogen 公司，APC/PE 融合的山羊抗鼠IgG 單抗購自Biolegend 公司，CFSE 細胞擴增試劑盒(C34554)購自Invitrogen/Molecular Probes 公司，靈長類非人動物Tregs 分離試劑盒(130-092-984)、Anti-mouse IgG 磁珠、MACS Multi-Stand(130-042-303)、LD(130-042-901)和MS(130-042-201)分離柱、MiniMACS(130-042-102)和MidiMACS(130-042-302)分離單位均為Miltenyi Biotec 產品。流式細胞儀Summit V4.3 分析軟件均為美國DakoCytomation 公司產品。

1.3 細胞分離 ①外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離:采用密度梯度離心法從15 mL EDTA 抗凝的獼猴外周血液中分離PBMCs。②Tregs 的分離:從PBMCs 中陰性分選CD4+T 淋巴細胞，再從CD4+T 淋巴細胞中陽性分選Tregs。具體分選方法參見試劑說明書。

1.4 CFSE 和PKH26 標記細胞 CFSE 標記去除Tregs 的PBMCs。PKH26 紅標記Tregs。具體標記方法參見試劑說明書。

1.5 Tregs 抑制功能分析-CFSE 基礎的細胞擴增分析實驗 具體方法參見文獻［4］。將CFSE 標記的、去除Tregs 的PBMCs 以2×105/孔的密度接種96 孔板，分6組。①空白對照組:除了CFSE 標記的PBMCs 外無任何添加。②CD3/CD28組:含純化鼠抗人CD3 和CD28 單克隆抗體(5 μg/L)。③PPD組:含PPD(15 L)。④Tregs組:將純化并經PKH26標記的Tregs 以2×105/孔的密度接種以上含CFSE標記的PBMCs 中，即①+④。⑤Tregs +CD3/CD28組:②+④。⑥Tregs +PPD組:③+④。每孔終體積為0.2 mL，用含有體積分數10% FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640 細胞培養液輕輕地混勻完全，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養7 d。培養7 d 后，收集細胞進行CD3、CD4、CD8、Vδ2熒光抗體染色。24 h 內使用流式細胞儀對經過熒光抗體染色的細胞進行檢測。使用Summit V4.3 軟件對CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+Vδ2+T 淋巴細胞的CFSE 信號強度進行分析，分析時根據SSC/FSC 和FSC/Pulse Width 點陣對PBL 設門，并排除PKH26+細胞的干擾。細胞擴增比例以CFSEdim細胞所占CFSE+細胞的百分比計算。

1.6 統計學處理 使用GraphPad 軟件，采用單因素方差分析和LSD-t 檢驗比較各組CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞擴增的比例，檢驗水準α=0.05。

2 結果

各組CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞的擴增比例見表1。

表1 各組CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞的擴增比例 %

3 討論

該研究中，作者采用一種敏感的、多用途的CFSE 基礎的實驗方法對Tregs 的抑制功能進行體外分析［9］。CFSE 是一種無色無熒光的染料，當和被染色細胞在37℃條件下共同孵育時，CFSE 被細胞攝入，從而均勻地散布在胞質中。CFSE 被胞質中的脂酶分解成熒光化合物，這種熒光化合物能和細胞內的胺類結合形成穩定的化合物，隨細胞分裂而存在于子代細胞中，只是熒光強度有所減弱。因此，利用CFSE 熒光強度減弱的特性，可以用于檢測CFSE 標記細胞的擴增情況。

通過CFSE 基礎的流式細胞術分析，作者證實中國獼猴Tregs 對Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞以及CD4+T淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞產生的PPD 抗原特異性和抗原非特異性擴增有強大的體外抑制功能。Tregs 不僅抑制傳統觀點認為的在抗結核感染免疫中發揮重要作用的CD4+T 淋巴細胞產生的PPD 抗原特異性的體外擴增，而且抑制CD8+T 淋巴細胞［10］和Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞［7］產生的PPD 抗原特異性的體外擴增。Tregs 具有體外抑制CD8+T 淋巴細胞和Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞產生的抗結核分枝桿菌抗原特異性擴增的功能，一方面表明最近人們越來越認識到CD8+T 淋巴細胞［10］和Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞［7］在機體產生的抗結核分枝桿菌感染免疫中的重要作用; 另一方面，這些證據表明Tregs 對在BCG 感染過程中共同發揮作用的、包括CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞［10］和Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞［7］在內的廣泛效應性/記憶性細胞池，都有著強大的負性調節作用。Tregs 在機體產生抗結核分枝桿菌感染免疫過程中，可能不僅控制傳統的CD4+T淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞［10］介導的抗結核分枝桿菌感染免疫，而且控制Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞介導的抗結核分枝桿菌感染免疫［7］。

總之，該研究結果表明，Tregs 可抑制CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴細胞介導的抗結核桿菌特異性免疫反應。

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