左心缺血再灌注大鼠急性肺損傷組織中ICAM-1與TNF-α的表達*

王煜霞，宋曉榮，姬明麗 ，王建剛，郭 勇，劉自國

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 新鄉(xiāng)453003 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院機能學(xué)實驗室 新鄉(xiāng)453003 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng)453003

#通訊作者，女，1975年7月生，碩士，副教授，研究方向:肺損傷機制及干預(yù)，E-mail:lmjsy@sina.com

部分左心心肌梗死的患者溶栓治療后，病情非但沒有緩解，反而導(dǎo)致呼吸功能障礙，因此探討左心缺血再灌注后急性肺損傷的機制可為臨床治療左心功能不全所致的急性呼吸衰竭提供理論基礎(chǔ)和實驗室依據(jù)。作者從左心缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型入手，探討?zhàn)じ椒肿?1 (inflammatory cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在左心缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及對呼吸功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60 只SD 大鼠購自河南省實驗動物中心，雌雄不限，體質(zhì)量250～350 g，采用隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，每組30 只。

1.2 主要儀器及試劑 BL-420 生物信號采集分析系統(tǒng)購于泰盟生物儀器有限公司; TNF-α 酶聯(lián)檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; TNFα 和ICAM-I SP-0023 免疫組化試劑盒購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物造模、檢測項目及方法 2組在進行胸部手術(shù)操作之前均在劍突下面作一小切口，暴露膈肌，將2 個針式電極掛于膈肌兩側(cè)，電極與BL-420 生物信號采集分析系統(tǒng)連接，記錄呼吸曲線。左心室缺血再灌注肺損傷模型的制作參考文獻［1］進行。實驗組大鼠全麻后開胸，結(jié)扎左冠狀動脈的前降支，30 min 后，剪開結(jié)扎線，恢復(fù)血供，造成缺血后再灌注損傷。對照組只穿線，不結(jié)扎此血管。

選擇缺血30 min(T1)、再灌注30 min(T2)、再灌注60 min(T3)3 個時間點，每個時間點各取10 只大鼠，在記錄呼吸曲線后均經(jīng)頸外靜脈取外周血5 mL，之后處死動物，取肺，行支氣管肺泡灌洗，取支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)5 mL; 采用酶聯(lián)免疫法分別檢測外周血和BALF 中TNF-α 的水平。

取肺右下葉，以40 g/L 多聚甲醛固定，石蠟包埋、5 μm 厚切片，HE 染色，光鏡下觀察各時間點2組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的變化，免疫組化SP 法檢測各時間點2組大鼠肺組織TNF-α、ICAM-1 的表達。TNF-α 免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)表達在細胞胞質(zhì)，呈棕黃色至深棕黃色顆粒。ICAM-1 免疫反應(yīng)陽性表達產(chǎn)物為棕黃色顆粒，分布于細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)。參考文獻［2］采用半定量法判定結(jié)果:選10 個高倍視野，每個視野計數(shù)100 個細胞，無明顯陽性細胞為“－”，陽性細胞百分比＜25% 為“+”，25%～為“”，＞75%為“”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0 處理數(shù)據(jù)，2組呼吸曲線參數(shù)的比較、BALF 和外周血中TNF-α 水平的比較采用2×2 析因設(shè)計的方差分析;2組大鼠各時間點肺組織ICAM-1、TNF-α 蛋白表達情況的比較采用秩和檢驗; 實驗組大鼠肺組織中ICAM-1 與TNF-α 蛋白表達的相關(guān)性采用spearman 秩相關(guān)分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 實驗組雙肺可見散在的淤血點，偶見融合的大面積淤血斑，以肺底部和背側(cè)面多見，輕擠切面有淡紅色泡沫樣液體溢出，T1 時肺間隔內(nèi)可見中性粒細胞、毛細血管擴張;T2 時可見肺泡間隔增厚，間隔內(nèi)中性粒細胞浸潤;T3 時可見彌漫性肺間隔增厚、浸潤明顯，有水腫液，呈急性炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)。對照組雙肺偶見淤血點，切面無泡沫樣液體溢出，未見中性粒細胞，肺泡間隔正常，無急性炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)。

2.2 2組大鼠呼吸曲線比較 3 個時間點實驗組大鼠呼吸曲線的幅度、強度和持續(xù)時間均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 2組大鼠呼吸曲線的比較(n=10)

2.3 2組大鼠外周血和BALF 中TNF-α 水平的比較 見表2。

2.4 2組大鼠肺組織中ICAM-1、TNF-α 蛋白的表達 見圖1(僅選擇T2 時2組大鼠肺組織ICAM-1、TNF-α 蛋白的表達情況)，表3、4。T1、T2、T3 時，實驗組大鼠肺組織ICAM-1 蛋白的表達與TNF-α 蛋白的表達均呈正相關(guān)，T1 時rS=0.362，P =0.001;T2時rS= 0.741，P = 0.001; T3 時rS= 0.803，P =0.026，見表5。

表2 2組大鼠外周血和BALF 中TNF-α 水平比較(n=10)ng/L

圖1 T2 時2組大鼠肺組織ICAM-1(A)和TNF-α(B)蛋白的表達(SP，×400)

表3 2組大鼠肺組織ICAM-1 表達的比較

表4 2組大鼠肺組織TNF-α 表達的比較

表5 實驗組大鼠肺組織中CAM-1 與TNF-α 蛋白表達的關(guān)系(n=10)

3 討論

該研究采用左心缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷，結(jié)果顯示與對照組相比，實驗組肺組織病理形態(tài)學(xué)改變呈急性炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)，且實驗組大鼠呼吸曲線的幅度、強度、持續(xù)時間均低于對照組，提示實驗組大鼠肺組織發(fā)生炎性反應(yīng)，引起呼吸功能減退，出現(xiàn)急性肺損傷。

中性粒細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞是炎性損傷過程的第一步，也是炎性損傷發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵。ICAM-1 是一種主要表達于內(nèi)皮細胞表面的跨膜糖蛋白，生理狀態(tài)下在大多數(shù)組織內(nèi)不表達或低表達［3-4］。當(dāng)病理性因素導(dǎo)致內(nèi)皮細胞表達ICAM-1上調(diào)時，上調(diào)的ICAM-1 與活化的中性粒細胞表面的整合素相互作用，而致中性粒細胞的變形性降低［5］，與血管內(nèi)皮細胞的黏附力大大增加，并向血管的特定部位遷移，從而發(fā)生白細胞黏附聚集，是介導(dǎo)中性粒細胞參與炎癥損傷級聯(lián)擴大反應(yīng)的基礎(chǔ)。TNF-α 是一種重要的前炎性細胞因子，可誘導(dǎo)多種化學(xué)趨化素和黏附因子的表達［6-8］。有實驗［9］證明中性粒細胞與TNF-α 作用后的肺微血管內(nèi)皮細胞通過ICAM-1 黏附，誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生氧自由基，中性粒細胞跨內(nèi)皮遷移及水腫形成。該研究結(jié)果顯示左心缺血再灌注誘導(dǎo)的肺損傷大鼠外周血和BALF 中TNF-α 水平增高，且肺組織ICAM-1 蛋白表達上調(diào)，證實了TNF-α 水平上調(diào)促使肺微血管內(nèi)皮細胞表達ICAM-1 增多。

此外，該研究結(jié)果還顯示實驗組大鼠肺組織ICAM-1 和TNF-α 蛋白表達均上調(diào)，二者的表達呈正相關(guān)，結(jié)合作者前期研究［10-11］結(jié)果:TNF-α 的表達上調(diào)會使肺部炎性細胞因子IL-8、IL-1β 等的表達上調(diào)，使炎癥反應(yīng)失衡，可進一步擴大炎性損傷，推測左心缺血再灌注后肺循環(huán)中TNF-α 增加，肺組織ICAM-1表達上調(diào)，細胞因子釋放增加，擴大炎癥反應(yīng)，炎癥級聯(lián)反應(yīng)失衡，引起炎癥損傷，導(dǎo)致呼吸功能減退。

綜上所述，左心缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷機制與TNF-α 誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達ICAM-1 上調(diào)，啟動白細胞的黏附聚集釋放反應(yīng)，擴大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，致炎癥反應(yīng)失衡有關(guān)。

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