重鉻酸鉀對大鼠睪丸支持細胞中雄激素結合蛋白、轉鐵蛋白和抑制素蛋白表達的影響

宋中立，劉海東，王祚懿，李時恩 ，陳小玉，姚 武，吳逸明

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州450001 2)乳山市疾病預防控制中心 乳山264500

#通訊作者，男，1955年2月生，本科，副教授，研究方向:工業毒理，E-mail:shienli369@126.com

鉻(chromium，Cr)廣泛存在于自然環境及工業生產環境中，目前鉻及其化合物尤其是六價鉻［Cr(Ⅵ)］對生殖系統的影響逐漸受到重視［1］。睪丸是雄性生殖系統中最重要的生殖腺，同時也是大多數外源化學物生殖毒性的靶器官，其中的支持細胞(sertoli cell，SC)是睪丸曲細精管內惟一的體細胞，在雄性生殖系統中起重要作用，其分泌的雄激素結合蛋白(androgen binding protein，ABP)［2］、轉鐵蛋白(transferrin，Tf)和抑制素(inhibin，INH)已被廣泛用作衡量SC 功能的標志［3］。該研究通過體外原代培養大鼠睪丸SC，使其暴露于不同濃度的重鉻酸鉀，從蛋白表達水平分析SC 中ABP、Tf 和INH 表達的變化，探討重鉻酸鉀對雄性生殖系統的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 18～21日齡的清潔級雄性SD 大鼠，體質量45～50 g，以睪丸未降出腹腔為準［購自河南省實驗動物中心，許可證號:SCXK(豫)2005-0001］。重鉻酸鉀(天津化工廠)，優級胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM-12 培養基(美國Gibco 公司)，即用型兔抗大鼠ABP 多克隆抗體、兔抗大鼠Tf 多克隆抗體、兔抗大鼠INH 多克隆抗體、兔抗大鼠GADPH 多克隆抗體(武漢市博士德生物工程有限公司)，ECL 顯色試劑盒(美國PIERCE 公司)。

1.2 原代支持細胞的分離培養及鑒定［4］將SD大鼠頸椎脫臼處死，取雙側睪丸，剪碎，分別用胰蛋白酶液和膠原酶Ⅰ液消化處理，加入DMEM/F-12培養基制成細胞懸液。用體積分數0.4%臺盼蘭染色計數活細胞數。以(2～4)×105mL－1細胞濃度接種至細胞培養瓶，37℃、體積分數5% CO2培養箱培養，48 h 后棄培養基，用20 mmol/L、pH 為7.4 的Tris-HCl 低滲純化，繼續培養48 h，然后將細胞制成細胞懸液，用Feulgen 染色法進行處理，光鏡下觀察。

1.3 實驗分組 調整純化后的細胞濃度為(2～4)×105mL－1，繼續培養48 h 后，將培養基更換為含重鉻酸鉀溶液的DMEM/F-12 培養基，根據預實驗結果設計染毒濃度，重鉻酸鉀的濃度分別為0 mol/L、10－7mol/L、10－6mol/L，每個濃度設8 個復孔。

1.4 ABP、Tf 及INH 蛋白表達的檢測 培養24 h后提取各組細胞中總蛋白，BradFord 法進行蛋白定量，計算各個樣品中的蛋白濃度，繪制標準曲線，確定蛋白上樣量。然后用Western blot 檢測ABP、Tf及INH 蛋白的表達，選用GAPDH 為內參對照，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、抗體免疫反應、化學發光、定影顯影等步驟，最后使用GENESNAP 軟件對所得的結果做半定量分析。

1.5 統計學處理 采用SPSS 12.0 處理數據，應用單因素方差分析和SNK-q 檢驗比較不同濃度重鉻酸鉀培養的細胞中ABP、Tf 及INH 蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Feulgen 染色鑒定 鏡下可見大鼠睪丸SC 骨架模糊，網狀分布，胞質呈綠色網狀，核淡紫色，核內一般可以看到分散的核仁，著色較淺，核仁兩側可見兩個深紫色顆粒(圖1箭頭所示，此深紫色顆粒與核仁呈三角形排列，為SC 特異的衛星核小體)，這說明培養存活的細胞即為SC。

2.2 3組細胞中ABP、Tf 和INH 蛋白表達的比較見圖2、表1。

表1 3組細胞中ABP、Tf 和INH 蛋白表達的量比較

3 討論

男性生殖能力下降所致不育癥越來越多，這已是無可爭議的事實。有研究［5］報道Cr(Ⅵ)易進入生殖細胞內而影響男性生殖系統的正常功能。作為睪丸曲細精管內惟一的體細胞，SC 具有營養、激素轉化、吞噬、屏障隔離及為生精細胞提供支架的作用，還具有非常重要的分泌功能，其分泌的生物活性物質具有調節生殖系統功能的作用［6］，其中關鍵的有ABP、Tf 和INH 等，這些物質可以用于評估SC 的功能［7］。徐蕊等［8］研究發現，大鼠睪丸SC ABP 分泌缺乏會致大鼠進行性不育。Tf 是SC 合成并分泌的一種轉鐵蛋白，很多外源化學物都可影響其在SC的表達與合成，Tf 含量的高低可以作為反映睪丸SC功能的特異性標記［9］。INH 由睪丸SC 直接產生，能反映睪丸內精子的發生情況。研究［10］發現，患有精索靜脈曲張男孩的INH B 水平較同一青春發育期的正常男孩低，說明INH B 可以作為SC 損傷與精子發生的標志物。

該實驗發現，隨Cr(Ⅵ)濃度的升高，ABP 與Tf蛋白的表達逐漸升高，但與0 mol/L 重鉻酸鉀組相比，ABP 蛋白只有10－6mol/L 時差異有統計學意義;而Tf 蛋白在10－7mol/L 和10－6mol/L 2 個濃度時均有統計學意義。還發現在10－6mol/L 濃度時，INH 蛋白的表達量降低，與0 mol/L 重鉻酸鉀組相比差異有統計學意義，這可能是由于重鉻酸鉀刺激的低劑量興奮效應所致。

綜上所述，不同濃度重鉻酸鉀作用于SC 后，細胞中可出現ABP、Tf 蛋白表達升高、INH 蛋白表達降低的變化，可能會引起雄性生殖能力的改變，甚至導致雄性生殖功能的障礙，其具體機制還有待進一步的實驗驗證。

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