卵巢上皮性癌組織中TGFBI基因啟動子甲基化及VEGF檢測

郭小芬，李紅雨，忽 平，張宏巖，高玉霞，賈冬麗

鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州450052

#通訊作者，女，1964年9月生，博士，主任醫師，研究方向:婦科腫瘤，E-mail:tjlhylucky@yahoo.com.cn

卵巢上皮性癌死亡率較高，嚴重威脅女性生命健康。近年來，隨著對腫瘤甲基化狀態研究的深入，越來越多抑癌基因的甲基化被認為與腫瘤的發生發展有關［1-2］。在人的腺癌細胞中，TGFBI 被認為是轉化生長因子β 誘導的基因，具有抑制腫瘤生長的作用，且有研究［3］表明腫瘤細胞系中TGFBI 基因沉默與其啟動子區域CpG 島甲基化高度相關。血管內皮生長因子(VEGF)及其受體是目前發現的最關鍵的促血管生長因子之一，它是腫瘤細胞自分泌的重要調節因子，參與調節腫瘤細胞的增殖和誘導血管生成，與腫瘤的生長、浸潤和轉移能力密切相關［4-5］。作者檢測了正常卵巢組織、卵巢良性上皮性腫瘤組織和卵巢上皮性癌組織中TGFBI 基因啟動子甲基化狀態及VEGF 蛋白的表達，探討卵巢上皮性癌組織中二者的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 標本來源:鄭州大學第三附屬醫院婦產科2008年8月至2011年3月的石蠟標本共計70例，患者術前均未接受放療和(或)化療，且均經病理學證實。患者年齡18～70 歲，其中正常卵巢組織20例(因子宮病變而行附件切除)，卵巢良性上皮性腫瘤組織20例，卵巢上皮性癌組織30例。主要試劑:甲基化專一性PCR 盒購自北京天恩澤基因科技有限公司;甲基化特異性PCR 引物(表1)由鄭州寶科生物技術有限公司設計和合成; VEGF 抗體及DAB 顯色試劑盒購自北京博奧森公司;SP 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

表1 甲基化分析所用引物序列及擴增產物大小

1.2 甲基化特異性PCR 采用氯仿-異戊醇法提取組織DNA;然后經過DNA 的亞硫酸鹽修飾，操作步驟按照甲基化專一性PCR 試劑盒說明書。PCR反應體系:經修飾后的DNA 2 μL，M(或U)上、下游引物各1 μL，10× BufferⅡ5 μL，dNTPs 4 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，加水至50 μL。PCR 反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環; 最后72℃延伸2 min。反應結束后取5 μL 產物進行20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像分析系統分析電泳結果。實驗中出現非甲基化條帶且無甲基條帶的判定為非甲基化;出現甲基化條帶而無非甲基化條帶的判定為甲基化;同時出現甲基化和非甲基化條帶的判定為半甲基化。甲基化和半甲基化都認為是發生了甲基化。

1.3 VEGF 蛋白表達的免疫組化檢測 石蠟包埋組織3 μm 厚連續切片，二甲苯常規脫蠟，具體按SP 試劑盒步驟進行。VEGF 抗體按1 ∶ 100 稀釋，滴加一抗4℃過夜，滴加二抗孵育30 min，DAB 顯色，中性樹膠封片。結果判定:以胞質中含有棕黃色顆粒的腫瘤細胞或血管內皮細胞計為陽性細胞。參照Siddiqui 等［5］的評判標準，高倍鏡下，每張切片選擇5 個視野，計數200 個細胞，利用陽性區平均灰度即積分光密度計算每張切片陽性細胞百分率，＜10%判定為陰性，≥10%為陽性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0 處理數據。3 種組織中TGFBI 基因啟動子甲基化率和VEGF 蛋白陽性表達率的比較應用χ2檢驗;卵巢上皮性癌組織中上述2 指標關聯性的檢驗應用Pearson 列聯系數分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3 種組織中TGFBI 基因啟動子的甲基化 見圖1、表1。

圖1 3 種卵巢組織中TGFBI 基因的甲基化狀態

表1 3 種卵巢組織中TGFBI 基因的甲基化率比較

2.2 3 種組織中VEGF 蛋白的表達 見圖2、表2。

圖2 3組卵巢組織中VEGF 蛋白的表達(SP，×400)

2.3 卵巢上皮性癌組織中TGFBI 基因啟動子甲基 化狀態和VEGF 蛋白表達的關聯性分析 見表3。

表2 3 種卵巢組織中VEGF 蛋白的表達

表3 卵巢上皮性癌組織中TGFBI基因啟動子甲基化狀態和VEGF 蛋白表達的關聯性分析

3 討論

DNA 甲基化是目前腫瘤研究中的一個重要方向。抑癌基因啟動子區CpG 島的甲基化將直接或間接抑制該基因的轉錄，導致下游基因的表達沉默。近年來研究［6］證實卵巢上皮性癌的發生與抑癌基因的異常甲基化密切相關。

TGFBI 是一種抑癌基因［7］。有研究［8］認為:TGFBI 基因甲基化與卵巢癌的發生密切相關，TGFBI 基因發生的甲基化可以作為鑒別惡性與良性腫瘤的新的標記物，其在正常細胞高表達，而在腫瘤細胞表達下調或缺失，這也往往是腫瘤發生的重要因素。有文獻［9］表明，在卵巢癌、肺癌和前列腺癌中TGFBI 基因的沉默都與自身甲基化有關。該研究結果顯示，TGFBI 基因啟動子在正常卵巢組織不發生甲基化，在卵巢良性上皮性腫瘤組織中發生很弱的甲基化，而在卵巢上皮性癌組織中發生了超甲基化，TGFBI 基因甲基化率在卵巢上皮性癌組織中明顯高于正常卵巢組織及卵巢良性上皮性腫瘤組織，表明TGFBI 基因啟動子在卵巢上皮性癌中發生的甲基化可能導致TGFBI 基因抑癌功能的減弱或喪失，從而促進卵巢上皮性癌的發生發展。

VEGF 定位于染色體6p21.3 上，它可與腫瘤細胞表面的VEGF 受體特異性地結合，通過降解血管內皮細胞基質和削弱血管的屏障作用，使新生血管的基底膜缺損加重，通過滲透作用，促進大量癌細胞進入血液循環，從而在多種腫瘤的血管生成、浸潤及轉移等過程中起關鍵作用［10］。該研究結果顯示VEGF 蛋白主要在胞質著色; 卵巢上皮性癌組織中VEGF 的陽性表達率明顯高于卵巢良性上皮性腫瘤，卵巢良性上皮性腫瘤組織中的VEGF 陽性表達率高于正常卵巢組織，提示VEGF 蛋白在卵巢上皮性癌中呈高表達，這種高表達可能與卵巢上皮性癌的血管生成有關。

此外，該研究結果還顯示，卵巢上皮性癌組織中TGFBI 基因啟動子的甲基化與VEGF 蛋白的表達有關聯，提示TGFBI 基因啟動子甲基化可能通過上調VEGF 蛋白的表達，促進新生血管生成，進而參與卵巢上皮性癌的發展。

總之，TGFBI 基因啟動子發生的超甲基化可能導致卵巢上皮性癌的發生; TGFBI 基因啟動子超甲基化可能與血管生成關系密切，為卵巢上皮性癌的臨床診治提供了一個新的思路和方向。

［1］Supic G，Kozomara R，Jovic N，et al.Prognostic significance of tumor-related genes hypermethylation detected in cancer-free surgical margins of oral squamous cell carcinomas［J］.Oral Oncol，2011，47(8):702

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［4］Diniz Bizzo SM，Meira DD，Lima JM，et al.Peritoneal VEGF burden as a predictor of cytoreductive surgery outcome in women with epithelial ovarian cancer［J］.Int J Gynaecol Obstet，2010，109(2):113

［5］Siddiqui GK，Maclean AB，Elmasry K，et al.Immunohistochemical expression of VEGF predicts response to platinum based chemotherapy in patients with epithelial ovarian cancer［J］.Angiogenesis，2011，14(2):155

［6］曲芃芃，石崢，李娜，等.卵巢上皮性癌細胞中E 鈣黏素基因的甲基化狀態及去甲基化的意義［J］.中華婦產科雜志，2009，44(7):538

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［10］高冬玲，郝志芳，殷智榕，等.卵巢上皮性腫瘤組織中微血管密度與VEGF 的表達［J］.鄭州大學學報:醫學版，2002，37(2):179