子癇前期患者胎盤組織中內皮分化基因2的表達

李留霞 ，吳改英，王 寧，張 毅，郭瑞霞，張孝艷

1)鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州450052 2)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州450052 3)鄭州大學生物工程系鄭州450001

△女，1962年11月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:婦科腫瘤和圍產醫學，E-mail:llxia698@163.com

子癇前期是妊娠婦女特有的疾病，以高血壓和蛋白尿為主要特征，是導致孕產婦及圍產兒死亡的重要原因，其發病機制至今尚不明確。血管內皮損傷及凝血異常是比較公認的子癇前期的病理機制之一［1］。研究［2］發現溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)來源于活化的血小板，可促進血小板聚集及血栓形成，與凝血功能異常及內皮損傷有關。LPA 主要通過其G 蛋白偶聯受體發揮作用，其特異性受體為內皮分化基因(endothelial differentiation gene，Edg)2、Edg3 和Edg4。作者前期的研究［3-4］發現LPA 在子癇前期婦女血中明顯升高，并且與疾病的嚴重程度相關，子癇前期患者胎盤組織中Edg4 和Edg7 蛋白表達明顯升高。該研究應用免疫組化SP法和RT-PCR 方法檢測子癇前期患者胎盤組織中Edg2 蛋白和mRNA 的表達，探討Edg2 與子癇前期發生發展的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇鄭州大學第一附屬醫院2010年11月至2011年5月收治的子癇前期患者40例，其中子癇前期輕度組20例，年齡22～41(30.1±4.9)歲，孕(36.3±2.8)周;重度組20例，年齡20～42(30.2±6.1)歲，孕(33.0±4.0)周。診斷標準參考文獻［1］的妊娠期高血壓疾病分類標準。選取同期入院正常晚期妊娠婦女20例作為對照組，年齡21～41(29.5±0.8)歲，孕(39.3±0.1)周。排除慢性高血壓、腎臟病病史、各類炎癥性疾病; 對照組無妊娠并發癥。

1.2 標本的采集及處理 妊娠婦女自然分娩或選擇性剖宮產，胎盤娩出后，迅速取出母面中央約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm 的組織，避開出血、鈣化、機化的部位。用生理鹽水反復漂洗后，1 份用干紗布吸去表面水分，裝入RNA 酶滅活的凍存管，迅速置于液氮中保存;另1 份置入甲醛溶液固定，用于免疫組化測定。

1.3 胎盤組織中Edg2 蛋白檢測 將胎盤組織常規石蠟包埋，4 μm 厚連續切片。常規脫蠟至水并微波修復抗原。采用免疫組化SP 法檢測，一抗為兔抗人Edg2 蛋白多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司產品)，稀釋100 倍使用，二抗為山羊抗兔IgG 抗體，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以PBS 代替一抗作為陰性對照。200 倍鏡下選取10 個視野，每個視野計數100 個細胞，參照Fromowitz 等［5］的綜合計分法進行半定量分析，根據陽性細胞分布范圍和染色強度確定Edg2 的表達水平。以胞膜或胞質出現明顯的棕黃色顆粒為陽性細胞，無著色或與背景顏色一致的為陰性細胞。陽性細胞百分數:≤5%為0 分，～25%為1 分，～49%為2分，≥50%為3 分; 陽性細胞著色強度:無著色為0分，淺棕褐色為1 分，棕褐色為2 分，深褐色為3 分;兩項評分相加:0～1 分為陰性，＞1 分為陽性。

1.4 胎盤組織中Edg2 mRNA 檢測 采用Trizol一步法提取胎盤組織總RNA，用逆轉錄試劑盒(加拿大Fermentas 公司)進行反轉錄后行PCR 擴增。引物均根據GenBank 數據庫目的基因cDNA 序列，由上海生工生物工程有限公司設計并合成。Edg2上游引物序列5’-GACCCAATACTCGGAGACTGAC-3’，下游引物序列5’-AACCACCATTACCACAAAG GTC-3’; 擴增產物大小為341 bp。內參照β-actin上游引物序列5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物序列5’-TGGAAGGTGGACAGCGAGG -3’，擴增產物大小為434 bp。PCR 反應條件:94℃預變性90 s;94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，35 個循環;72℃延伸5 min。PCR 擴增產物經含20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，應用Quantity One 軟件對凝膠電泳圖像進行分析，以Edg2 與β-actin 條帶灰度值的比值作為Edg2 mRNA 相對表達量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0 處理數據，3組胎盤組織中Edg 2 蛋白陽性表達率的比較應用χ2檢驗，胎盤組織中Edg2 mRNA 的相對表達量應用單因素方差分析及LSD-t 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組胎盤組織中Edg2 蛋白的表達 3組胎盤組織中均可檢測到Edg2 蛋白的表達，主要表達于絨毛滋養細胞和蛻膜細胞的胞質和胞膜，見圖1。各組胎盤絨毛滋養和蛻膜細胞中Edg2 蛋白陽性表達率的比較見表1。

圖1 3組胎盤絨毛滋養細胞(A)和蛻膜細胞(B)中Edg2 蛋白的表達(SP，×200)

表1 3組胎盤組織中Edg2 蛋白和mRNA 的表達

2.2 3組胎盤組織中Edg2 mRNA 的表達 結果見圖2、表1。

圖2 3組胎盤組織中Edg2 mRNA 的表達

3 討論

LPA 是一種具有細胞間信號傳導作用的多功能磷脂分子，通常以自分泌或旁分泌的形式釋放到細胞外，主要通過特異性G 蛋白偶聯受體發揮各種生物學功能［6］。LPA 可來源于多種細胞，主要來源于活化的血小板，血小板活化后在磷脂酶作用下水解膜磷脂產生LPA，釋放入血，作為血漿的正常成分調節一些正常的生命活動［7-9］。LPA 與高血壓進展與維持有關［10］。

作者前期研究［4］顯示，妊娠期高血壓病患者血漿LPA 水平均較正常晚孕組升高，且子癇前期患者血漿LPA 濃度最高。有研究［11］發現Edg2 能誘導細胞凋亡，可能通過非依賴LPA 途徑發揮作用。據此推測，LPA 可能通過Edg2 在子癇前期患者胎盤組織細胞凋亡中發揮一定作用。LPA 可能與胎盤組織中不同組織細胞上的受體結合后發揮不同的作用:LPA 與胎盤滋養細胞受體結合后引起或通過影響其他細胞因子誘導細胞凋亡，使其母血物質交換功能下降;LPA 與胎盤蛻膜細胞受體結合，影響細胞內鈣離子濃度變化，使血壓升高，促使血管收縮和血小板凝集，并可能與胎盤局部血管硬化性病變有關。該研究發現，Edg2 蛋白在患者胎盤絨毛滋養和蛻膜細胞中呈高表達，Edg2 mRNA 在患者胎盤組織中呈高表達，且與疾病的嚴重程度有關，提示LPA 受體Edg2 可能參與了子癇前期疾病的發生。

總之，胎盤組織中LPA 受體Edg2 異常高表達可能促進子癇前期疾病的發生發展。

［1］豐有吉，沈鏗.婦產科學［M］.2 版.北京:人民衛生出版社，2010:80

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［4］李留霞，周蔚，喬玉環，等.妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中溶血磷脂酸受體蛋白Edg4、7 的表達及其意義［J］.中華婦產科雜志，2007，42(6):386

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［11］顧建娟，蘇悅，汪萍.卵巢腫瘤患者血漿溶血磷脂酸水平及Edg-2/Edg-7 表達研究［J］.南通大學學報:醫學版，2006，26(6):432