氯化鋰對人骨肉瘤細胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表達的影響

趙意華，陳清漢 ，華海嬰，姜玉軍，秦建英，任明明

1)鄭州大學第二附屬醫院骨科 鄭州450014 2)鄭州大學醫藥科學研究院 鄭州450052

#通訊作者，男，1963年5月生，碩士，教授，研究方向:骨科疾病的基礎與臨床，E-mail:chenqinghan833@medmail.com.cn

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，好發于兒童和青少年股骨遠端、脛骨近端，易轉移至肺、腦等組織［1］，因而愈后較差。研究［2］表明，其發生機制主要與原癌基因激活和抑癌基因失活有關。目前臨床治療方法以手術結合多種藥物化療［3］為主，但常用化療藥物如順鉑(PDD)、大劑量環磷酰胺(HDMTX)長期應用副作用較大，效果不理想。鋰是一種人體非必需微量元素，具有免疫調節作用，并在體內外具有廣譜抗腫瘤作用; 其化合物氯化鋰(LiCl)在體外可抑制多種腫瘤細胞增殖并誘導凋亡［4］。目前，LiCl 對人骨肉瘤細胞系(U2-OS)作用的研究尚未見文獻報道。作者觀察了LiCl 在體外對U2-OS 細胞增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA 表達的影響，探討其可能的作用機制，為骨肉瘤的藥物治療尋求新的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 U2-OS、LiCl、細胞凋亡及細胞周期檢測試劑盒(鄭州創生生物公司)，DMEM 培養基(Gibco 公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、MTT(Sigma 公司)，酶標儀(Thermo 公司)，流式細胞儀(Benekman 公司)。以GAPDH 為內參照。精密稱取1.695 g LiCl 溶于20 mL 三蒸水中，配制成2.0 mol/L 母液，過濾后4℃保存備用，臨用時加入培養基稀釋至終濃度。

1.2 細胞培養 U2-OS 細胞貼壁生長于含體積分數10%胎牛血清的DMEM 培養基中，置于37℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，2～3 d 傳代1 次。

1.3 實驗分組 取對數生長期U2-OS 細胞，胰酶消化后調整細胞濃度為1.0×105mL－1，接種于培養板內，置于37℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，24 h 后棄去舊液，分組培養，每組設5 個平行孔。正常對照組用等容積培養液培養，陽性對照組加用15 mg/L 5-FU，藥物組分別加入40、80、150 mmol/L LiCl 溶液。

1.4 觀測指標

1.4.1 細胞增殖抑制率 細胞分別培養24、48 和72 h 后，加MTT(5 mg/L)20 μL，培養4 h 后棄去培養液，加200 μL DMSO，待結晶顆粒充分溶解后，在酶標儀490 nm 處測定吸光度(A)，根據公式計算細胞增殖抑制率:增殖抑制率=(1 －實驗組A/對照組A)×100%。

1.4.2 凋亡和細胞周期 取各組細胞接種于6 孔板內培養，48 h 后收集細胞于1.5 mL EP 管內，加500 μL Annexin-binding Buffer 重懸細胞并調整濃度為(1.0～5.0)×106mL－1，加Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，避光染色5 min 后，上流式細胞儀檢測凋亡;加PI(50 mg/L)1 mL，4℃避光染色30 min，上流式細胞儀進行細胞周期分析。

1.4.3 Fas、Caspase-3 mRNA 檢測 各組細胞培養24 h 后用PBS 清洗，之后冰上操作，Trizol 法提取RNA，按照試劑盒說明進行逆轉錄，取逆轉錄產物行PCR 擴增。PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。Fas 后引物序列5’-GCCACCCCAAGTAGATCT GG-3’，前引物序列 5’-ACTGTGACCCTTGCAC CAAAT-3’; Caspase-3 后引物序列5’-GCATACT GTTTCAGCATGGCAC-3 ’，前引物序列 5 ’-CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG-3’。PCR 反應條件:預變性94℃(GAPDH)或98℃(Caspase-3 和Fas)5 min; 變性94℃30 s，退火58℃(GAPDH)或54℃(Caspase-3)或59℃(Fas)30 s，延伸72℃45 s，總循環35 次(GAPDH)或34 次(Fas 和Caspase-3)。反應結束后取PCR 產物5 μL，行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統進行掃描，以目的條帶與GAPDH 條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對表達量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0 處理數據，應用單因素方差分析比較各組細胞增殖抑制率、細胞周期、凋亡率及Fas、Caspase-3 mRNA 相對表達量，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 LiCl 對U2-OS 細胞增殖的影響 增殖抑制率測定結果見表1。

表1 5組增殖抑制率測定結果(n=5)%

2.2 LiCl 對U2-OS 細胞周期和凋亡的影響 結果見表2。

2.3 LiCL 對U2-OS 細胞中Fas、Caspase-3 mRNA 表達的影響 結果見表3。

表2 4組U2-OS 細胞的細胞周期和凋亡率(n=5)

表3 4組Fas 和Caspase-3 mRNA 的相對表達量(n=3)

3 討論

研究［5-6］發現，骨肉瘤的發生發展涉及細胞內許多基因的改變，而某些基因的表達在促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長方面具有重要意義［7-8］，其中Fas/FasL 和Caspase 系統在細胞凋亡過程中起重要作用。Fas 基因作為重要的凋亡調控基因，位于人類染色體10q，其編碼產物相對分子質量約為45 000，是一種Ⅰ型跨膜受體蛋白，屬于腫瘤壞死因子/神經生長因子(TNF/NGF)受體超家族，該蛋白是誘導細胞程序性死亡的信號分子［9］，在正常細胞內可通過信號傳導途徑逐級放大死亡信號，通過相應受體傳導至細胞核內部，引起核內轉錄基因的改變，從而啟動凋亡程序。FasL 基因位于染色體1q23［10］，主要分布于活化的T 細胞和NK 細胞，其編碼產物相對分子質量為31 000，為Ⅱ型跨膜蛋白，屬于TNF 家族，可與其配體Fas 蛋白特異性結合，形成配體受體復合體，將細胞外的凋亡信號轉導至細胞內部。Caspase 是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶［11］，是由Caspase 基因家族轉錄表達的一類具有酶切作用的蛋白質，目前已發現14 種［12］，其中Caspase-3 是主要的凋亡執行蛋白，在被上游分子激活后能分解細胞骨架蛋白、細胞器等結構，參與細胞凋亡的具體執行過程［13］。Fas、FasL 和Caspase 家族在細胞凋亡過程中分別起著發出凋亡死亡信號、感知并轉導信號且逐級放大至細胞內部、接受信號激活級聯反應并產生效應等一系列作用。此系統是細胞凋亡的最主要途徑之一，其中Caspase 蛋白的表達是各種細胞凋亡機制的最后共同通路，在細胞的信號傳遞過程中處于重要地位［14］。

該研究結果顯示，LiCl 對體外培養的U2-OS 細胞具有顯著的增殖抑制作用和凋亡誘導作用，且上述作用表現出劑量依賴性;細胞周期測定結果顯示，LiCl 可使U2-OS 細胞G1期細胞百分比下降，S 期細胞百分比則增高，且二倍體峰值隨藥物劑量增大呈下降趨勢，表明細胞被阻滯于S 期。以上結果初步證實LiCl 有抑制骨肉瘤細胞生長，促進凋亡的作用。進一步的檢測結果顯示，LiCl 作用后，U2-OS 細胞中Fas 和caspase-3 mRNA 的表達水平異常增高。因此，作者認為，LiCl 可促進U2-OS 細胞的凋亡，抑制其生長，上調促凋亡基因Fas 的表達，而Fas/FasL和Caspase 介導的死亡信號轉導系統則可能是其作用機制之一。

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