辛伐他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠內(nèi)臟脂肪組織中內(nèi)脂素及瘦素mRNA表達(dá)的影響

李京曄，趙玉蘭，董 靜

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州450014

#通訊作者，女，1956年7月生，主任醫(yī)師，教授，研究方向:心力衰竭、冠心病及其相關(guān)疾病，E-mail:zyl6616@126.com

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)［1］。內(nèi)脂素、瘦素均是由內(nèi)臟脂肪組織分泌的細(xì)胞因子，近年來(lái)的研究［2-3］表明，兩者與缺氧、易損斑塊破裂、內(nèi)皮功能紊亂、炎癥和糖脂代謝等關(guān)系密切，與AS 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。他汀類藥物可以通過(guò)調(diào)脂作用來(lái)防治AS。辛伐他汀是HMG-CoA 還原酶抑制劑類藥物的一種［1］。作者采用RT-PCR 法檢測(cè)觀察了辛伐他汀對(duì)高脂高熱量飼養(yǎng)所致AS 大鼠內(nèi)臟脂肪組織中內(nèi)脂素、瘦素表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 健康雌性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量180～200 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。基礎(chǔ)飼料由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上添加膽固醇、煉豬油等混合烤制成高脂高熱量飼料。辛伐他汀片(10 mg/片)由江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司提供。Trizol 試劑、RT-PCR 試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR 引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將40 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、小劑量和大劑量辛伐他汀組，每組10 只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組始終以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，余3組均以高脂高熱量飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。喂養(yǎng)10 周后對(duì)照組及模型組各取1 只大鼠冠脈血管做病檢，驗(yàn)證是否發(fā)生AS。之后模型組按5 mg/(kg·d)灌胃生理鹽水，小劑量和大劑量辛伐他汀組分別按2.5 和5.0 mg/(kg·d)灌胃辛伐他汀。4 周后，分別取4組大鼠尾靜脈血2 mL 備用;然后稱重、麻醉，處死在無(wú)菌條件下取肝臟、腓腸肌、大網(wǎng)膜等內(nèi)臟脂肪組織，液氮保存?zhèn)溆?取大鼠冠脈血管做病檢，觀察血管形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 冠脈血管形態(tài)學(xué)觀察 剪取主動(dòng)脈根部靠近主動(dòng)脈瓣環(huán)處約0.5 cm 腹主動(dòng)脈，甲醛固定，石蠟包埋，于完整的血管結(jié)構(gòu)處連續(xù)切片，固定于載玻片上，HE 染色，顯微鏡下觀察。

1.3.2 動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)測(cè)定 酶法測(cè)定總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，按公式計(jì)算AI，AI=(TC－HDL-C)/HDL-C。

1.3.3 內(nèi)臟脂肪組織中內(nèi)脂素、瘦素mRNA 檢測(cè)采用RT-PCR 法。取大鼠內(nèi)臟脂肪組織約100 mg，加入液氮完全研碎，按Trizol 說(shuō)明書操作，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以GAPDH 為內(nèi)參照。GAPDH 上游引物序列5’-AGGGGCCATC CACAGTCTTC-3’，下游引物序列5’-CAGTGCCA GCCTCGTCTCAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為595 bp。內(nèi)脂素上游引物序列5’-GCTAAGAAGGCGATACAA-3’，下游引物序列5’-AGAATGAGGACTGGGTGA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為323 bp。瘦素上游引物序列:5’-TGGGCAATGGGTTGGTAATC-3’，下 游 5’-TGGA CAATGGCAAGGTAGCG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為259 bp。PCR 擴(kuò)增體系:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，dNTPs 4 μL，酶緩沖液5 μL，Tap 酶0.5 μL，上、下游引物各1 μL，超純水36.5 μL，共50 μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán);72℃總延伸6 min。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。以目的條帶與GAPDH 條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0 處理數(shù)據(jù)，各指標(biāo)組間比較采用單因素方差分析及LSD-t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠冠脈血管病理表現(xiàn) 見(jiàn)圖1。對(duì)照組管腔圓形，內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚。模型組管壁明顯增厚，平滑肌增生明顯，細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜增厚，存在脂質(zhì)沉積等AS 樣改變。大劑量辛伐他汀組管壁較模型組變薄，內(nèi)膜和平滑肌細(xì)胞變化介于對(duì)照組和模型組之間，動(dòng)脈壁細(xì)胞排列較對(duì)照組紊亂。小劑量辛伐他汀組管壁較模型組變薄，較大劑量辛伐他汀組稍厚，其內(nèi)膜和平滑肌細(xì)胞變化介于模型組和大劑量辛伐他汀組之間。

圖1 4組大鼠冠脈血管病理表現(xiàn)

2.2 4組大鼠AI 及內(nèi)臟脂肪組織中內(nèi)脂素、瘦素mRNA 的表達(dá) 見(jiàn)圖2、表1。

圖2 4組大鼠內(nèi)臟脂肪組織中內(nèi)脂素(上)、瘦素(下)mRNA 的表達(dá)

表1 4組大鼠AI 及內(nèi)臟脂肪組織中內(nèi)脂素、瘦素mRNA 測(cè)定結(jié)果

3 討論

AS 主要累及大中動(dòng)脈，導(dǎo)致相應(yīng)臟器缺血和損傷，是造成心腦血管疾病和死亡的重要原因［1］。脂質(zhì)代謝異常是其最重要的危險(xiǎn)因素。他汀類藥物通過(guò)AS 競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMG-CoA 還原酶活性，阻斷肝臟內(nèi)膽固醇合成，促進(jìn)LDL 受體的轉(zhuǎn)錄，改變極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL)的組成等，可引起VLDL 合成減少和LDL 產(chǎn)生減少［1］。他汀類藥物同時(shí)還具有改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，影響血管平滑肌細(xì)胞增殖，干擾血小板聚集、凝血、纖溶過(guò)程和拮抗炎性反應(yīng)等調(diào)脂外作用［4］。臨床研究［2］表明他汀類藥物可以有效改善AS 患者的預(yù)后。該研究結(jié)果也顯示，辛伐他汀可有效降低AS 模型大鼠的AI，同時(shí)減輕AS 模型大鼠冠脈血管的病理變化。

研究［3-4］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)脂素可通過(guò)旁分泌/自分泌途徑作用于內(nèi)臟脂肪組織，促進(jìn)脂肪組織的分化、合成與積聚。Kim 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)脂素通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2，促進(jìn)內(nèi)皮大量新生血管生成，導(dǎo)致血管平滑肌增殖，引起動(dòng)脈硬化斑塊擴(kuò)大、破裂和血栓形成。瘦素是1994年被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)脂肪細(xì)胞因子，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)高瘦素水平與AS 密切相關(guān)，是AS 獨(dú)立的危險(xiǎn)因子［6］。Yamagishi 等［7］的實(shí)驗(yàn)表明，瘦素可增加單核細(xì)胞趨化蛋白1 的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)線粒體超氧化物的產(chǎn)生，增加氧自由基，導(dǎo)致長(zhǎng)期反復(fù)氧化應(yīng)激，從而加速AS 的形成。Corsonello等［8］研究發(fā)現(xiàn)高水平瘦素通過(guò)協(xié)同二磷腺苷，促血小板聚集、增加血小板內(nèi)游離Ca2+的濃度，從而促進(jìn)血小板的黏附與聚集，增加血液黏度，促進(jìn)血栓形成，從而促進(jìn)AS 的形成和發(fā)展。

作者觀察到AS 模型大鼠內(nèi)臟脂肪組織中內(nèi)脂素、瘦素表達(dá)水平明顯升高;而辛伐他汀灌胃后大鼠內(nèi)臟脂肪組織中2 者的表達(dá)水平明顯降低，尤其大劑量辛伐他汀組變化更為明顯。

綜上所述，內(nèi)脂素、瘦素可能促進(jìn)了AS 的發(fā)生發(fā)展，而辛伐他汀可能通過(guò)降低2 者的表達(dá)，從而穩(wěn)定斑塊，延緩AS 進(jìn)程，這可能是其調(diào)脂外的又一作用。

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