不同冷凍載體對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的影響

海 蘭，譚 麗 ，毛跟紅，馬麗影，趙冬梅，項(xiàng)云改，李 艷

1)美國(guó)南伊利諾伊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理系 卡本戴爾62901 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心 鄭州450014

#通訊作者，女，1964年3月生，博士，教授，研究方向:生殖內(nèi)分泌，E－mail:litan668@zzu.edu.cn

成熟的減數(shù)第二次分裂中期(MⅡ期)卵母細(xì)胞的冷凍保存是目前最佳的生殖能力儲(chǔ)備方法。玻璃化冷凍技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、快捷高效、節(jié)約成本而受到青睞。由于玻璃化冷凍保護(hù)劑的高濃度、高毒性易造成冷凍過(guò)程中卵母細(xì)胞的損傷，冷凍載體及方法的選擇一直是相關(guān)研究中的熱點(diǎn)，但面對(duì)多種載體，人們尚未找到最佳的方案。該實(shí)驗(yàn)采用普通麥管、封閉式拉細(xì)麥管(closed pulled straws，CPS)和開(kāi)放式拉細(xì)麥管(open pulled straws，OPS)玻璃化冷凍小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞，觀察復(fù)蘇后體外受精及發(fā)育潛能，旨在找尋一種相對(duì)高效而且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的凍存方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與動(dòng)物

玻璃化冷凍液的制備:參考文獻(xiàn)［1］的方法。以美國(guó)Gibco 公司生產(chǎn)的Dulbecco’s 磷酸緩沖液(DPBS)加入體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清(FBS)為基礎(chǔ)冷凍保護(hù)液，基礎(chǔ)冷凍保護(hù)液中加入1.5 mol/L的乙二醇(美國(guó)Sigma 公司)為預(yù)平衡液，基礎(chǔ)冷凍保護(hù)液加入5.5 mol/L 的乙二醇和1.0 mol/L 的蔗糖為玻璃化冷凍液。復(fù)蘇液采用四步復(fù)蘇法配制，在基礎(chǔ)冷凍保護(hù)液的基礎(chǔ)上分別加入1.000、0.500、0.250、0.125 mol/L 的蔗糖。將所配制的玻璃化冷凍液及復(fù)蘇液離心、過(guò)濾后置于4℃冰箱避光保存，于取卵日取出于室溫下靜置。授精液滴的配制:將含體積分?jǐn)?shù)5%FBS 的1020 液在35 mm 的培養(yǎng)皿中制成50 μL 的微滴，表面以礦物油覆蓋。生長(zhǎng)液滴的配制:將含體積分?jǐn)?shù)5%FBS 的1026 液在培養(yǎng)皿中制成20 μL 的微滴，表面以礦物油覆蓋。授精液滴和生長(zhǎng)液滴均在取卵當(dāng)天配制完畢并置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中平衡6 h 以上。

6～8 周齡的健康普通級(jí)昆明系雌性小鼠15只，體質(zhì)量20～25 g，用于獲取成熟的卵母細(xì)胞。8～15 周齡的健康普通級(jí)昆明系雄性小鼠，體質(zhì)量30～35 g，用于獲取精子。以上小鼠均購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。清潔普通級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.2 成熟卵母細(xì)胞的采集 15 只6～8 周齡雌性小鼠于晚22:00 時(shí)分別腹腔注射10 IU 人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)，48 h 后再次腹腔注射10 IU 人絨毛膜促性腺激素(HCG)，16～18 h 后以頸椎脫臼法處死，無(wú)菌操作下打開(kāi)腹腔，分離并剪下輸卵管和卵巢，在DPBS 中清洗3～4 遍后迅速移至含體積分?jǐn)?shù)5%FBS 的1020 液的帶凹皿中。解剖顯微鏡下用1 mL 注射器撕開(kāi)輸卵管的膨大部，收集卵母細(xì)胞和卵母細(xì)胞復(fù)合體COCs。根據(jù)COCs 的形態(tài)學(xué)判斷卵母細(xì)胞的成熟度［2］。共取得可見(jiàn)第一極體的成熟MⅡ卵母細(xì)胞166 枚，將其移入含有體積分?jǐn)?shù)5%FBS 的1020 授精液滴中，并放入培養(yǎng)箱中等待冷凍。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與玻璃化冷凍與復(fù)蘇處理 將成熟的卵母細(xì)胞按照隨機(jī)數(shù)字表法分為凍融組、暴露組和對(duì)照組。凍融組卵母細(xì)胞分別用普通麥管、CPS、OPS 載體進(jìn)行玻璃化冷凍。暴露組將新鮮的成熟卵母細(xì)胞分別暴露于玻璃化冷凍液和復(fù)蘇液中，但未投入液氮中進(jìn)行冷凍。對(duì)照組卵母細(xì)胞直接進(jìn)行體外受精，不接觸冷凍液和復(fù)蘇液。將小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞于預(yù)平衡液中平衡5 min，然后移入玻璃化冷凍液中。普通麥管和CPS組采用氣柱五段式裝管法［3］。OPS組裝管時(shí)手持麥管的一端，用另一端輕觸冷凍液滴，卵母細(xì)胞和微量的玻璃化冷凍液(大約1～2 μL)便會(huì)因虹吸作用進(jìn)入細(xì)管的前端。裝管后的麥管立即直接投入液氮中。各種裝管過(guò)程均需嚴(yán)格控制在1.0～1.5 min。卵母細(xì)胞的復(fù)蘇:普通麥管和CPS組均從液氮中取出麥管，室溫下停留5 s，37℃水浴10 s［2］，用無(wú)菌剪刀在遠(yuǎn)端(第一段空氣柱處)剪斷，將含有卵母細(xì)胞的一段液體排至含1.000 mol/L 蔗糖的復(fù)蘇液中，靜置2.5 min 后再依次 移 至 分 別 含 有0.500 mol/L、0.250 mol/L、0.125 mol/L蔗糖復(fù)蘇液中，每孔停留2.5 min。最后將復(fù)蘇存活的卵母細(xì)胞放入基礎(chǔ)液中清洗，然后移入授精液滴等待受精。OPS組從液氮中取出后首先氣浴5 s，隨后將遠(yuǎn)端直接浸入含1.000 mol/L 蔗糖的復(fù)蘇液中，待玻璃化部分液化以后便與復(fù)蘇液融合，靜置2.5 min 后剩余步驟與上述相同。冷凍和復(fù)蘇均須在24～26℃室溫下進(jìn)行，同時(shí)避光。

1.4 卵母細(xì)胞體外受精及卵裂 對(duì)于復(fù)蘇后及暴露后體外培養(yǎng)1 h 后形態(tài)正常的卵母細(xì)胞［細(xì)胞存活，無(wú)胞質(zhì)的碎裂和(或)透明帶的松解或脫落］進(jìn)行體外受精。在授精液滴中每個(gè)MⅡ期卵母細(xì)胞周圍加5～10 萬(wàn)條精子，然后移至37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中。授精后16～24 h 在倒置顯微鏡下(×200)觀察受精及卵裂情況。胚胎質(zhì)量的評(píng)估參照盧惠霖等［4］的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0 處理數(shù)據(jù)，各組小鼠成熟卵母細(xì)胞的回收和存活率的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)或精確概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同載體玻璃化冷凍復(fù)蘇的小鼠成熟MⅡ期卵母細(xì)胞的回收和存活率比較 見(jiàn)表1。

表3 各組小鼠卵母細(xì)胞回收及存活率比較

2.2 不同方法處理卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇后體外受精及胚胎發(fā)育情況 見(jiàn)表2。

表2 不同方法處理卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇后體外受精及胚胎發(fā)育情況

3 討論

生殖技術(shù)的應(yīng)用過(guò)程中，取卵日精液或精子無(wú)法取出的情況時(shí)有發(fā)生，如果能將卵子冷凍保存將是最佳的補(bǔ)救措施，否則在沒(méi)有供精可選或不愿用供精時(shí)只能廢棄所獲得的卵子，這不僅是一種經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)，而且是對(duì)女性生育力的極大浪費(fèi)。尋找一種簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)有效的卵子冷凍法逐漸成為相關(guān)研究中的焦點(diǎn)。隨著玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展，卵母細(xì)胞冷凍獲得快速發(fā)展［5－6］。與慢速冷凍相比，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍具有簡(jiǎn)單快捷而且高效的優(yōu)點(diǎn)，且玻璃化冷凍的臨床妊娠率高于慢速冷凍法［7］。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道較多的玻璃化冷凍載體為Cryoloop、Cryoleaf 等，價(jià)格昂貴。作者選擇了價(jià)錢(qián)相對(duì)低廉且制作方法簡(jiǎn)單的普通麥管及CPS 和OPS 用于實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，CPS 和OPS組復(fù)蘇后卵母細(xì)胞的存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均高于普通麥管組。這一結(jié)果與Chen 等［8］的研究結(jié)果相符。影響存活率的首要原因是冷凍速率的不同。普通的0.25 mL冷凍麥管內(nèi)徑大約1.7 mm，管壁厚度約為0.15 mm，其裝載的冷凍保護(hù)劑體積幾乎為拉細(xì)麥管(內(nèi)徑0.8 mm，管壁厚度0.07 mm)的2 倍。液體容量的增加意味著熱傳遞耗時(shí)的延長(zhǎng)。且普通麥管組采用多段式方法裝管，裝管時(shí)間的延長(zhǎng)也在一定程度上增加了卵母細(xì)胞與乙二醇的接觸時(shí)間。因此拉細(xì)麥管作為卵母細(xì)胞冷凍的載體優(yōu)于普通麥管。由于CPS 在回收率方面優(yōu)于OPS，而且封閉式避免了胚胎與液氮接觸所造成的潛在污染，因此是較理想的載體。

由于高濃度冷凍保護(hù)劑對(duì)胚胎有一定的毒性，該實(shí)驗(yàn)中，降低玻璃化冷凍保護(hù)劑乙二醇的濃度為5.5 mol/L，蔗糖濃度為1 mol/L。為了檢測(cè)卵母細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)液的耐受性，作者另外設(shè)置了暴露組，即將小鼠成熟卵母細(xì)胞按照冷凍復(fù)蘇的順序先后在各個(gè)濃度梯度的冷凍復(fù)蘇液中依次停留規(guī)定的時(shí)間但未裝管且無(wú)投入液氮避免了冷凍復(fù)蘇液對(duì)卵母細(xì)胞的影響，結(jié)果表明，僅有1 枚卵母細(xì)胞在此過(guò)程之中發(fā)生胞質(zhì)顏色變暗及細(xì)胞的死亡，其原因可能源于操作技能，其余卵均存活，說(shuō)明在沒(méi)有冷凍的條件下，卵母細(xì)胞是有能力抵御并承受住由高濃度的冷凍保護(hù)劑到濃度逐漸降低的復(fù)蘇液所帶來(lái)的滲透壓的改變，而且受精率達(dá)89.7%，這一結(jié)果與Chen等［8］觀察到的結(jié)果相符合。該研究中新鮮及凍融的小鼠卵母細(xì)胞均采用體外受精，凍融組的卵裂率為38.6%，較對(duì)照組和暴露組降低。由于凍融后卵子透明帶變厚會(huì)影響卵裂率和植入率，如果采用卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)和透明帶去除或打孔的方法則可以大大提高卵母細(xì)胞凍融后的卵裂率，將會(huì)獲得更高的卵裂率。

綜上所述，普通麥管法是效率最低的玻璃化冷凍方法，OPS 的冷凍效率最高，然而卻存在著潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)［9］。在臨床應(yīng)用中，無(wú)菌的控制和污染的避免是先決條件，因此CPS 在玻璃化冷凍保存成熟的卵母細(xì)胞方面的價(jià)值值得肯定。

［1］Zhou XL，Al Naib A，Sun DW，et al.Bovine oocyte vitrification using the cryotop method:effect of cumulus cells and vitrification protocol on survival and subsequent development［J］.Cryobiology，2010，61(1):66

［2］羅麗蘭.不孕與不育［M］.2 版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009.

［3］Stachowiak EM，Papis K，Kruszewski M，et al.Comparison of the level(s)of DNA damage using comet assay in bovine oocytes subjected to selected vitrification methods［J］.Reprod Domest Anim，2009，44(4):653

［4］盧惠霖，盧光琇.人類生殖與生殖工程［M］.鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社，2001.

［5］嚴(yán)正杰，蔡令波，馮婷，等.卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對(duì)胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2009，18(1):17

［6］Liu L，Milroy C，Peterson CM，et al.Successful cryoloop vitrification and subsequent in vitro maturation of mouse preantral follicles［J］.Syst Biol Reprod Med，2011，57(3):149

［7］Smith GD，Serafini PC，F(xiàn)ioravanti J，et al.Prospective randomized comparison of human oocyte cryopreservation with slow－rate freezing or vitrification［J］.Fertil Steril，2010，94(6):2088

［8］Chen SU，Lien YR，Chen HF，et al.Vitrification of mouse oocytes using CPS achieves a high survival and preserves good patterns of meiotic spindles，compared with conventional straws，OPS and grids［J］.Hum Reprod，2001，16(11):2350

［9］Parmegiani L，Cognigni GE，Bernardi S，et al.Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes［J］.Reprod Biomed Online，2011，23(4):505