血紅蛋白在戊二醛膜修飾金電極上的直接電化學行為及其與氨茶堿的相互作用*

閔文傲， 王衛平， 袁軍華， 陳建榮

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

血紅蛋白(Hb，hemoglobin)是血液中運輸氧氣的主要物質，因其結構確定、分布廣泛，一直是研究血紅素類蛋白質直接電化學及生物傳感和電催化的理想模型．Hb直接電化學的研究會遇到電活性中心難以暴露、電子傳輸緩慢等難題，目前常用蛋白質膜技術形成適宜的蛋白-電極界面以加強Hb的電子轉移，如：Hb-生物模擬膜界面［1-4］、Hb-納米粒子界面［5-7］、Hb-聚合物膜界面［8］等，這些界面不僅能為Hb提供一個類似于其生物膜的微環境，保持其自然結構和生物活性，而且能阻止雜質及Hb變性吸附引起的電極鈍化，加速Hb與電極之間直接、可逆的電子交換反應．文獻［9］用雞蛋卵磷脂包埋固定Hb于玻碳電極表面，在形成的界面上可以得到Hb可逆的氧化還原峰．

戊二醛(GA，glutaraldehyde)是一種理想的交聯試劑，可以與Hb的多種氨基酸殘基發生非特異性反應，使Hb形成聚合物，但不影響Hb的生物活性．文獻［10］用GA作交聯劑，將Hb偶聯到熱解石墨電極表面．GA不僅增強了Hb的剛性結構，保持了蛋白質的自身特性，而且當其吸附在電極表面時又避免了Hb的變性，因此可容易地實現電極上的直接電子轉移．文獻［11］將GA交聯的辣根過氧化物酶納米粒子直接固定在金電極表面，促進了辣根過氧化物酶在金電極上的電子轉移．文獻［12］用GA作為手臂分子偶聯的方法將氨基酸修飾到金電極上，并以該修飾電極為工作電極，利用方波伏安法對痕量銅離子進行了檢測．

氨茶堿是廣譜的平喘藥物，可松弛支氣管平滑肌，也能松弛腸道、膽道等多種平滑肌，對支氣管粘膜的充血、水腫有緩解作用［13］．但因其安全性范圍較小，常需進行臨床藥物監測．已報道的研究氨茶堿與蛋白質相互作用的方法有熒光光譜法［14］和高效液相色譜(HPLC)法［15］．

本文通過GA將Hb修飾到金電極上，利用循環伏安法研究了該修飾電極在磷酸鹽緩沖溶液中的電化學行為;并利用制備的Hb/GA膜修飾電極，研究了Hb與氨茶堿之間的相互作用，構建了氨茶堿的電化學傳感器．

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

CHI 832B型電化學工作站(上海辰華儀器公司)，使用標準三電極體系：Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，金電極(或修飾金電極)為工作電極;pHS-3CT精密pH計(上海智光儀器儀表有限公司);SB-5200 DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)．

血紅蛋白(Hb，上海博蘊生物科技有限公司);戊二醛(GA，上海化學試劑采購供應五聯化工廠);氨茶堿(AMP，Sigma公司)．其他試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水．

1．2 修飾電極的制備

將金電極在涂有Al2O3懸濁液的麂皮上拋光至鏡面，依次用水和1∶1乙醇溶液超聲清洗20 s左右，然后置于1 mol/L H2SO4溶液中進行循環伏安(CV)掃描直至穩定．

把經過預處理的金電極置于 5．0×10－5mol/L Hb溶液中，于1．5～2．0 V 電沉積90 min，使Hb充分吸附在電極表面，自然干燥后加1～2滴GA，室溫下使溶劑揮發形成修飾膜，即可得Hb/GA膜修飾金電極．

1．3 實驗方法

以Hb/GA膜修飾金電極或裸金電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，以 0．1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 6．00)為支持電解質，在一定電位范圍內進行循環伏安(CV)實驗，記錄相應的CV曲線．每次使用后將電極用水沖洗干凈．所有實驗均在室溫下進行．

2 結果與討論

2．1 Hb在修飾電極上的電化學行為

分別將裸金電極(Au)、GA膜修飾金電極(GA/Au)和Hb/GA膜修飾金電極(Hb/GA/Au)置于PBS(pH 6．00)中進行CV掃描，結果見圖1．由圖1可知，裸金電極、GA膜修飾金電極沒有氧化還原峰(見圖1中b，c)，Hb/GA膜修飾金電極有一對很好的氧化還原峰(見圖1中a)，可逆性也明顯改善，說明Hb能夠滲透進入GA膜中與其發生某種作用而具備了發生直接電化學反應的特定取向．在100 mV/s掃描速度下，其氧化峰電位Ep，a和還原峰電位 Ep，c分別為 0．341 V 和 0．297 V，峰電位差ΔE為44 mV，氧化還原峰電流之比Ip，a/Ip，c=1．17，說明 Hb 在 GA 膜修飾電極上的氧化還原過程是可逆過程，GA膜對Hb的吸附固定和在電極上的直接電子轉移起到了重要的作用．

圖1 不同電極的循環伏安圖

2．2 底液及pH的選擇

用循環伏安法考察了不同的支持電解質(Britton-Robinson(B-R)，HAc-NaAc，Tris-HCl和磷酸鹽緩沖溶液)對Hb在修飾電極上電化學行為的影響．從圖2可以看出，Hb在0．1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中的峰形好、峰電流高，有最好的電流響應．Hb在修飾電極上的電化學行為隨磷酸鹽緩沖溶液pH值的變化情況見圖3．從圖3可以看出：當溶液pH值為4．00～6．00時，氧化峰電流隨pH值的增大而增大，表明Hb的電子轉移強度逐漸增大;pH值為6．00～8．00時，氧化峰電流隨pH值的增大而下降，表明Hb電子轉移強度逐漸減小．這主要是因為Hb的活性依賴于溶液pH(正常人體生理pH為6．0～8．5)，過低或過高的pH都會降低Hb的活性．此外，隨pH值的變化，Hb的氧化峰電位變化不大．因此，考慮到Hb的生物特性，選用pH 6．00的0．1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液作為測試底液．

圖2 Hb在不同緩沖溶液中的循環伏安圖

圖3 pH對Hb在修飾電極上電化學行為的影響

2．3 掃描速率的影響

考察了不同掃描速率(0．2～1．0 V/s)下Hb/GA/Au電極的循環伏安行為，結果見圖4．從圖4可以看出，Hb/GA/Au電極的CV圖具有近似對稱的峰形和幾乎等高的陰極峰和陽極峰，且隨著掃描速率的增大，陽極峰電位正移，陰極峰電位負移．陽極峰電流與掃描速率成正比(見圖5，其線性關系為：峰電流 Ip=85．609v+1．610 7，相關系數R=0．999 4)．說明Hb的電極反應是受表面控制的過程．

2．4 電沉積時間的影響

圖4 不同掃描速率下Hb/GA/Au電極的CV圖

圖5 Hb修飾電極峰電流與掃描速率間的關系

圖6 不同電沉積時間下Hb修飾電極的CV圖

本實驗采用包埋法固定Hb分子到金電極表面得到Hb/GA/Au修飾電極，考察了電沉積時間分別為30，60，90 min時對修飾電極靈敏度的影響．由圖6可見：若電沉積時間過短，則沒有明顯的峰電流，隨著電沉積時間的增長，峰電流逐漸增大;但當電沉積時間過長(＞90 min)時，峰電流也隨之減小，且陽極峰電位向正方向移動．這可能是因為：當電沉積時間過短時，Hb分子還未聚合到電極表面就進行包埋;隨著電沉積時間的增長，Hb固載量增加，峰電流逐漸增大;但當電沉積時間過長時，由于包埋Hb的環境發生改變，電極表面物質的分布趨于復雜，Hb在電極表面過量吸附，降低了電子的傳遞能力，且造成了電極響應電流下降的趨勢．因此，選擇電沉積時間為90 min．

2．5 修飾電極的穩定性

將Hb/GA/Au修飾電極在相同條件下反復進行CV掃描11次，測定陽極電流的變化趨勢，根據所得數據求出其相對標準偏差為0．06%．將此修飾電極置于0．1 mol/L PBS(pH 6．00)中放入4℃冰箱保存，每天進行CV掃描，3 d后電流下降了約10%，表明此電極有良好的穩定性．

2．6 氨茶堿與Hb的相互作用

文獻［16-17］報道電活性小分子結合生物大分子后會形成一種非電活性的配合物，不能在電極表面發生氧化還原反應，從而降低了Hb的平衡濃度，使Hb的氧化還原電流降低．本實驗用CV法研究氨茶堿與Hb之間相互作用的結果表明，隨著所加入氨茶堿濃度的增大，Hb的氧化還原電流呈下降趨勢，當氨茶堿的濃度達到一定程度時，電流下降程度趨于平緩，說明此時Hb與氨茶堿之間的結合基本達到飽和．因此，可以認為氨茶堿與Hb形成了一種非電活性超分子化合物．

對于Hb與氨茶堿(AMP)形成的非電活性超分子化合物，可結合文獻［18-19］求算出兩者相互作用的結合數m．假設兩者生成簡單的化合物Hb-mAMP，方程式

的平衡常數為

由此，可得到以下關系式：

從而，可以推出

圖7 lg(ΔI/ΔImax－ΔI)與 lg［AMP］的關系

式(6)中：ΔI為有無氨茶堿的峰電流之差;ΔImax是電流變化的最大值．如果Hb與AMP形成單一的化合物，則 lg(ΔI/ΔImax－ ΔI)與 lg［AMP］應呈線性關系，斜率m即為結合數．以lg(ΔI/ΔImax－ΔI)為縱坐標，lg［AMP］為橫坐標，進行線性擬合(見圖7)，可得到擬合方程：y=0．034 9x －0．124 1，相關系數R=0．987 9，計算得結合數m=2．

3 結論

以GA作為偶聯劑將Hb固定于金電極表面，制得了Hb/GA膜修飾金電極，GA膜的存在加快了Hb與金電極間的電子轉移．結果表明，Hb在GA膜修飾金電極上的電子轉移過程是一個受吸附控制的氧化還原過程．利用此修飾電極，用CV法研究了Hb和平喘藥物氨茶堿之間的相互作用，求得Hb和氨茶堿的結合數為2．

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