Maspin 在前列腺癌PC－3 細胞生物學行為中的作用

劉美琴， 周 珺， 馬 亮， 國 風

(蘇州大學附屬第一醫院中心實驗室，江蘇 蘇州215006)

乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(mammary serine protease inhibitor，maspin)是絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)超家族中的一個獨特成員［1］。maspin 表達的臨床意義受制于遺傳背景、組織類型和基礎表達水平等因素［2］。在包括前列腺癌在內的多種實體瘤中，maspin 被認為是一個抑癌基因。本研究中，我們通過RNA 干擾技術并建立穩定轉染細胞系來探討maspin 如何影響前列腺癌細胞生物學行為的變化。

材 料 和 方 法

1 主要試劑、抗體和儀器

RPMI－1640 購自Gibco－BRL;胎牛血清購自杭州四季青公司;限制性內切酶Hpa I 和Xho l 購自NEB;質粒小抽和大抽試劑盒購自Omega;SyberGreen Mix 購自美季公司;M－MLV 購自Invitrogen;轉染試劑Fugene HD 和蛋白酶抑制劑購自Roche;maspin 抗體(554292)購自BD Bioscience;RelA(sc－8008)和RelB(sc－226)抗體購自Santa Cruz Biotechnology;β－actin 抗體(AA128)購自碧云天公司;熒光Ⅱ抗購自Li－cor;MG－132 購自Sigma;流式細胞儀FACSCalibur 購自BD Bioscience;熒光倒置顯微鏡購自Olympus;NanoDrop 購自Thermo;LightCycler? 480 實時熒光定量PCR 儀和xCELLigence 系統購自Roche;Odyssey 紅外熒光掃描成像系統購自LI－COR。

2 細胞培養

雄激素非依賴型前列腺癌細胞株DU145 和PC－3 細胞為我實驗室長期保存，培養于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640完全培養體系中，在37℃、5%CO2和飽和濕度的培養箱中培養。包裝細胞Phoenix A(由中科院動物所趙勇教授贈送)培養于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 完全培養體系中。應用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，2 ～3 d 傳代1 次，選用對數生長期的細胞進行后續實驗。

3 Maspin－shRNA 的設計和表達載體的構建

按shRNA 靶序列的設計原則，針對maspin 基因的靶位點設計RNA 干擾片段，具體為1 171－1 189位(5’－ GCACAAGGATGAATTGAAT－3’)并在Invitrogen 公司合成。將慢病毒載體pLL3.7(中科院動物所趙勇教授贈送)用Hpa I 和Xho l 酶切并去磷酸化，然后將合成的shRNA 正鏈和負鏈退火并連接至pLL3.7 載體，連接產物轉化到DH5α 大腸桿菌中，質粒小量抽提鑒定后進一步測序鑒定(華大基因公司)，鑒定好的載體質粒采用試劑盒大量制備。

4 建立穩定轉染maspin－shRNA 細胞系

接種0.5 ×106Phoenix A 細胞至35 mm 細胞培養皿，待細胞生長至70%～80%融合度時進行細胞轉染。細胞轉染試劑為Fugene FD，具體操作如說明書。包裝載體為pCMV－VSV－G 和pCMV－dR8.9，與制備好的pLL3.7－shRNA 質粒(pLL3.7－siMaspin 或pLL3.7－control)共轉染。pLL3.7－control 為實驗陰性對照(non－silencing siRNA)。轉染18 h 后熒光顯微鏡下觀察GFP 信號并更換新鮮的DMEM 完全培養基。48 h 后，1 500 r/min 離心獲得含有病毒顆粒的上清，用0.45 μm 的濾器過濾除去細胞碎片等雜質。將病毒上清和目的細胞(PC－3)混勻，培養48 h 后，用極限稀釋細胞克隆形成法得到單克隆轉染細胞。

5 實時熒光定量RT－PCR(qRT－PCR)

Trizol 一步法抽提細胞總RNA 并用NanoDrop 定量。取2 μg RNA 參照M－MLV 逆轉錄酶操作說明書逆轉錄合成cDNA。qRT－PCR 反應在LightCycler?480 實時熒光定量PCR 儀上完成。每個反應均設3 復孔，反應共40 次循環。以β－actin 作為內參照，檢測每個反應管內熒光強度達到設定域值時所經歷的循環數(即Ct 值)，mRNA 的相對表達水平用2－ΔΔCt方法進行計算。引物設計使用Primer－BLAST 軟件(NCBI)。

6 全蛋白提取

將5 ×106細胞用預冷的PBS 洗1 次，快速加入3 ～5 倍體積的緩沖液，再加入同體積的2 ×十二烷基硫酸鈉凝膠上樣緩沖液。95 ℃加熱10 min 后立即置于冰上，用1 mL 注射器反復抽吸約20 次，室溫，10 000 r/min 離心10 min，轉移上清置－80 ℃冰箱保存。

7 Western blotting 法檢測蛋白的表達

細胞裂解液，經12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入I 抗于4 ℃孵育過夜。熒光標記的II 抗(1∶2 000 稀釋)2 h 室溫孵育，PBST(含1%Tween 的PBS)洗膜，用Odyssey 紅外熒光掃描成像系統檢測待測蛋白。

8 實時細胞分析

使用xCELLigence 系統 與RTCA 1.2 軟件進行細胞指數(cell index，CI)測定，并于E－Plate 16 中進行持續監測。“細胞指數”是由測得的電阻抗(electrical impedance)頻譜推得的一種無量綱參數，其數值反映細胞數目(活細胞或貼附細胞數目)。無細胞狀態下，加樣孔(E－Plate 16)底部排列的微電極陣列的阻抗分布近似均勻;加入細胞后，細胞與電極表面接觸，影響電極和溶液間離子環境，導致電阻抗升高。細胞越多電阻抗增加越多，即細胞指數值越高。用100 μL 含10% FCS 的RPMI－1640 進行細胞培養的背景電阻抗檢測。每孔體積調為100 μL，密度為3 000 個細胞。接種后，電阻抗以固定時間間隔被測定，對細胞持續監測5 d。

9 流式細胞儀檢測細胞死亡

收集0.5 ×106個細胞，用流式緩沖液洗1 次，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液50 μL，室溫下避光孵育5 min，用流式緩沖液洗滌后，將細胞重懸于300 μL 的流式緩沖液中，在流式細胞儀上進行t 檢驗或細胞死亡檢測。

10 統計學處理

結 果

1 雄激素非依賴型前列腺癌細胞株中maspin 的表達

以β－ actin 為對照，通過Western blotting 法檢測了雄激素非依賴型前列腺癌細胞株DU145 和PC－3 細胞中maspin 的表達情況。DU145 細胞中maspin 的蛋白表達較低，而PC－3 細胞中maspin 的蛋白表達顯著高于前者，見圖1，故選用PC－3 細胞進行靶向沉默maspin 的實驗。

Figure 1. The expression of maspin in DU145 and PC－3 prostatic cancer cells. ±s.n=4. * P ＜0.05 vs DU145.圖1 前列腺癌DU145 和PC－3 細胞中maspin 的表達

2 穩定轉染maspin－shRNA 細胞系的建立與鑒定

采用極限稀釋細胞克隆形成法分別得到單克隆轉染細胞PC－3－siMaspin1 和PC－3－siMaspin2，熒光實時定量qRT－PCR 法檢測結果顯示PC－3－siMaspin1 和PC－3－siMaspin2 細胞的maspin mRNA表達水平相比較PC－3－control 細胞有明顯變化，約呈4 倍下降，見圖2A。

Western blotting 法檢測結果顯示，PC－3－si-Maspin1 和PC－3－siMaspin2 細胞系的maspin 蛋白表達水平顯著低于PC－3－control 細胞組，分別降低4 倍和6.4 倍，見圖2B，故選用PC－3－siMaspin2 細胞進行后續實驗。

Figure 2. The expression of maspin in PC－3 cells after transfection with maspin－shRNA. A:qRT－PCR analysis of maspin mRNA expression in prostate cancer cells;B:Western blotting analysis of maspin protein expression in whole－cell extracts of prostate cancer cells. ±s.n=3. ＊＊ P ＜0.01 vs PC－3－control.圖2 maspin－shRNA 轉染PC－3 細胞對maspin mRNA 和蛋白表達水平的影響

通過普通倒置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡觀察PC－3－siMaspin2 細胞，可見綠色熒光蛋白在細胞內廣泛表達，見圖3A。進一步采用流式細胞術檢測到綠色熒光蛋白在PC－3－siMaspin 2 細胞中的表達率可達到95.99%，見圖3B。

Figure 3. Detection of flurorescence signal and GFP expression in PC－3－siMaspin2 cells. A:PC－3－siMaspin2 cells were detected using fluorescence microscope. a:phase－contrast microscope;b:fluorescence microscope. B:flow cytometric analysis of GFP expression in PC－3－siMaspin2 cells and PC－3－control cells.圖3 Maspin－shRNA 穩定轉染細胞系中熒光信號的觀察

3 Maspin 沉默對PC－3 細胞生長的影響

細胞計數顯示PC－3－control 與PC－3－si-Maspin2 細胞在接種后的第1 d 生長相似，而在第3 d PC－3－siMaspin2 細胞生長明顯快于PC－3－control 細胞，見圖4A。通過xCELLigence 系統對5 d 生長過程的細胞指數進行動態檢測，結果顯示，第1 d兩組細胞的生長速度相似(P ＞0.05)，第2 d 起PC－3－siMaspin2 細胞生長明顯快于PC－3－control細胞(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖4B。PC－3－si-Maspin2 細胞的倍增時間為26.83 h，而PC－3－control 細胞的倍增時間為37.95 h。

4 Maspin 沉默對細胞凋亡相關基因表達的影響

qRT－PCR 結果顯示，抗凋亡基因(bcl－2 和A20)在PC－3－siMaspin2 細胞mRNA 表達水平較PC－3－control 細胞有不同程度升高;而促凋亡基因(bax 和bim)在PC－3－siMaspin2 細胞mRNA 表達水平較PC－3－control 細胞有不同程度降低，見圖5。

Figure 4. The effect of maspin silencing on cell growth and proliferation of PC－3 cells. A:growth curves of PC－3－control and PC－3－siMaspin2 cells. ±s. n =4. * P＜0.05 vs PC－3－control. B:the proliferation of PC－3－control and PC－3－siMaspin2 cells dynamically detected using xCELLigence system. ±s.n=3.圖4 Maspin 沉默對PC－3 細胞的生長和增殖的影響

Figure 5. The expresison of bcl－2，A20，bax，and bim mRNA in PC－3－control and PC－3－siMaspin2 cells analyzed by qRT－PCR. ±s. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PC－3－control.圖5 PC－3－control 和PC－3－siMaspin2 細胞bcl－2、A20、bax 和bim mRNA 的表達

5 蛋白酶體抑制劑對PC－3－siMaspin2 細胞的作用

應用蛋白酶體抑制劑MG－132(1 μmol/L)處理PC－3－control 和PC－3－siMaspin2 細胞，采用PI染色法檢測細胞死亡率，未處理時細胞死亡率分別為9.2%±5.6%和3.8%±1.2%，MG－132 作用8 h細胞死亡率分別為27.1%±5.6%和7.5%±2.3%;作用24 h 細胞死亡率為24.2%±3.7%和8.2% ±2.5%，作用36 h 細胞死亡率為28. 7%±3. 7% 和7.6%±2.5%，見圖6A。故PC－3－siMaspin 2 細胞其自發性死亡率比PC－3－control 細胞低，在MG－132 作用后PC－3－control 細胞的死亡率呈時間依賴性上升，PC－3－siMaspin2 細胞的死亡率比PC－3－control 細胞顯著降低。xCELLigence 系統連續觀察細胞生長5 d，結果顯示PC－3－control 細胞數隨時間增長而減少，而PC－3－siMaspin2 細胞數無明顯變化，見圖6B。

Figure 6. The effects of MG－132 treatment on the survival of PC－3－control and PC－3－siMaspin2 cells. A:PI－positive cells detected by flow cytometric analysis;B:the prolifertion of PC－3－control and PC－3－si-Maspin2 cells dynamically detected using xCELLigence system. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs PC－3－control.圖6 MG－132 對PC－3－control 和PC－3－siMaspin2 細胞的毒性作用

6 Maspin 基因沉默對蛋白酶體抑制劑誘導的NFκB 蛋白表達的影響

Western blotting 法檢測結果顯示，PC－3－control 細胞在MG－132(1 μmol/L)作用下RelA 的表達逐漸下調，而PC－3－siMaspin2 細胞中RelA 的表達無明顯變化。PC－3－control 和PC－3－siMaspin2細胞中RelB 的表達均無顯著變化，見圖7。

Figure 7. The effects of MG－132 treatment on the expression of RelA and RelB in PC－3－control and PC－3－si-Maspin2 cells. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs 0 h.圖7 MG－132 對PC－3－control 和PC－3－siMaspin2 細胞RelA 和RelB 蛋白表達的影響

討 論

Maspin 是1994 年用消減雜交(subtractive hybridization)技術對正常乳腺組織和乳腺癌組織進行比較時發現的一個腫瘤抑制基因。Maspin 基因編碼產物為serpin 超家族中的一個獨特成員，定位和或分泌于細胞漿及細胞核內［3］。最初的研究表明maspin 是一抑癌基因，可以通過促凋亡蛋白Bax 的介導而促進細胞凋亡從而抑制腫瘤細胞的生長［4］。Maspin 在不同腫瘤類型中表達意義不一，例如在乳腺癌、肝癌和肺鱗癌中maspin 的過表達預示預后良好［5］。原發性前列腺癌中maspin 的表達顯著下降，并與病理分級、臨床分期和淋巴結轉移等臨床表現相關，為預后較差的一個獨立因素［6］。本研究中我們利用慢病毒包裝系統建立了靶向沉默maspin 的PC－3 細胞系。利用xCELLigence 系統進行實時細胞觀測，發現靶向沉默maspin 的PC－3 細胞相比對照細胞生長速度明顯加快，倍增時間明顯縮短。另外，maspin 表達的降低導致自發性凋亡率減少，與促凋亡基因(bax 和bim)mRNA 表達水平下調的同時抗凋亡基因(bcl－2 和A20)mRNA 表達水平上調具有相關性。以上結果均表明maspin 表達沉默賦予了雄激素非依賴型前列腺癌細胞株PC－3 更強的腫瘤性，即maspin 在PC－3 細胞中起到抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用。

核因子κB(NF－κB)家族成員包括RelA/p65、p50、RelB、p52 和c－Rel，在炎癥發生、細胞增殖與凋亡和腫瘤形成等多種生物學過程中發揮作用［7］。以RelA－p50 二聚體為代表的經典性NF－κB 的持續活化在前列腺癌發生發展中起重要作用并被認為是前列腺癌的共同特點［8］。代表著非經典通路活性的RelB 蛋白逐漸被證實與實體瘤的發生發展相關，包括乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等［9］。RelB 作用于前列腺的癌變過程并賦予了前列腺癌細胞的輻照耐受，嚴重影響前列腺癌的療效［10－12］。最新研究認為RelB 在maspin 的表達調控中起重要作用，但RelA并不影響maspin 蛋白的表達［13－14］。蛋白酶體抑制劑通過抑制NF－κB 依賴性的基因轉錄，已經廣泛應用于多發性骨髓瘤、套細胞淋巴瘤以及急性髓細胞白血病患者的治療。PC－3 細胞中NF－κB 呈持續性活化。當PC－3 細胞受到蛋白酶體抑制劑MG－132 作用時，采用xCELLigence 系統實時監測并結合PI 染色法觀察到細胞出現時間依賴性死亡并伴隨RelA 蛋白表達的下調;而在maspin 沉默的PC－3細胞中并未出現明顯的細胞死亡，但細胞生長受到抑制，同時RelA 蛋白表達未發生明顯變化。RelB 蛋白的表達在對照和maspin 沉默的PC－3 細胞變化不顯著。以上結果均說明maspin 表達沉默賦予了PC－3 細胞對蛋白酶體抑制劑的耐藥性，并與RelA 的表達的變化直接相關。

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