EPCAM、CD44 和CD24 在胃癌組織中的表達及其臨床意義*

楊世斌， 肖隆斌， 許峰峰， 吳文輝， 李守智， 李明哲

(中山大學附屬第一醫院黃埔院區普外科，廣東 廣州510700)

上皮細胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)、白細胞分化抗原44 (cluster of differentiation 44，CD44)和白細胞分化抗原24 (cluster of differentiation 24，CD24)是不同腫瘤干細胞的表面標記。EPCAM+CD44+可作為結直腸癌干細胞的表面標記［1］。Takaishi 等［2］發現CD44+可作為胃癌干細胞的表面標記。胃癌AGS 細胞系中CD44+CD24+是胃癌干細胞的表面標記［3］，也有認為EPCAM+CD44+可作為胃 癌 干 細胞表面 標記［4］，EPCAM+CD44+CD24+可作為胰腺癌干細胞的表面標記［5］。目前尚無聯合檢測胃癌中以上指標的文獻資料，本文聯合檢測EPCAM、CD44 和CD24 在胃癌組織中的表達，并分析其與臨床病理特點及預后的關系。

材 料 和 方 法

1 一般資料

數據源于中山大學附屬第一醫院胃癌診治中心數據庫，剔除伴嚴重基礎疾病的病人，選取2003 年5月至2004 年6 月胃癌95 例，同時取25 例癌旁正常黏膜組織作為陰性對照，均行手術治療，未經術前放化療。病理結果均由2 名高級別的病理醫生做診斷。簽署知情同意書。術后將病理標本蠟塊行免疫組化檢測，同時對95 例患者治療情況進行預后分析。

2 主要試劑材料

兔抗人CD24 多克隆抗體購自ABGENT，兔抗人CD44 單克隆抗體購自EPITOMICS，兔抗人EPCAM多克隆抗體及抗體稀釋液購自北京博奧森公司。二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒及緩沖稀釋液、原液購自基因科技(上海)有限公司。

3 方法

選取已有病理診斷的胃癌石蠟塊，以每張3 mm厚切片，置于63 ～65 ℃烤箱1 ～2 h。將切片浸于二甲苯中脫蠟3 次，每次5 min;100%、90%、80%、70%梯度乙醇洗2 次，每次3 min;蒸餾水洗3 min;將切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92 ～98 ℃之間并持續10 ～15 min，室溫下自然冷卻;蒸餾水洗2 次，每次1 min;3%H2O2浸泡切片，室溫靜置10 min;或微波爐低火1 min;PBS 洗3 次，每次3 min;取出切片，甩掉并擦干組織周圍的液體(組織切勿干燥)，平放于濕盒，滴加Ⅰ抗(工作液)100 μL，37 ℃溫箱孵育1 h;孵育完畢，用PBS 洗3 次，每次3 min;滴加Ⅱ抗100 μL，37 ℃溫箱孵育30 min;PBS 洗3 次每次3 min;DAB 工作液顯色1 ～5 min，在顯微鏡下控制顯色程度，當顯色合適時用蒸餾水沖洗終止反應;Mayer 蘇木素復染3 min，蒸餾水沖洗3 ～5 min;各級濃度乙醇(70%～100%)脫水、二甲苯透明、封片膠封片、鏡檢。

判定原則及標準:(1)必須同時設對照染色。沒有對照染色的免疫組化染色結果是不可信的。(2)抗原表達必須在特定部位。不在抗原所在部位的陽性著色，一律不能視為陽性。(3)避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細胞的陽性表達。

4 統計學處理

數據應用SPSS 13.0 軟件進行統計學處理，率的比較用χ2檢驗，多變量分析用Logistic 回歸，累積生存率根據壽命表法計算，生存曲線用Kaplan－Meier法分析，多因素用Cox 回歸分析，生存率比較用logrank 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 免疫組化結果

EPCAM 表達陽性56 例，陽性率58.95%;CD44表達陽性41 例，陽性率43.16%;CD24 表達陽性56例，陽性率58.95%。其中EPCAM+CD44+30 例，陽性率 31. 58%;EPCAM+CD24+45 例，陽 性 率47.37%;CD44+CD24+32 例，陽性率33. 68%;EPCAM+CD44+CD24+25 例，陽性率26.32%。陰性對照組這3 種蛋白的陽性率分別為16.00%、8.00%和20.00%，見圖1。

2 95 例胃癌患者病例多因素Cox 回歸分析

Figure 1. The expression of EPCAM，CD44 and CD24 in tumor tissues and normal gastric mucosae (immunohistochemical staining，×400).A，D，G:positive expression in gastric adenocarcinoma;B，E，H:negative expression in gastric adenocarcinoma;C，F，I:control group.Black arrows referred to positive staining，and the others referred to negative staining.圖1 EPCAM、CD44 及CD24 在胃癌組織及正常黏膜中的表達

對95 例胃癌術后患者的資料進行Cox 回歸分析，將所有因素納入分析范圍，結果顯示對其生存率有影響的是腹水、盆結節、腹膜侵犯、EPCAM、CD44、三者皆陽性、分化和浸潤程度，差異有統計學意義(P＜0.05)，而根治術式、組織學分型和腫瘤部位在顯著性水平附近。如果患者合并腹水、盆腔轉移結節、腹膜種植侵犯、低分化、EPCAM 及CD44 陽性或三指標陽性時相對危險度將明顯增加，而CD24 陽性、印戒細胞癌、BORRMANN Ⅳ型和淋巴結轉移時危險度分別增加55.4%、30.7%、54.3%、10.9%和30.6%，見表1。

3 臨床病理指標的單因素分析結果

EPCAM 與年齡、腫瘤浸潤深度和WHO 組織學分型有關;CD44 與BORRMANN 分型、WHO 組織學分型和CEA 值有關;CD24 與浸潤深度、腫瘤位置、WHO 組織學分型和臟器侵犯有關;三者陽性與浸潤深度、腫瘤位置和WHO 組織學分型有關，見表2。

4 與患者術后生存率分析比較

EPCAM 或CD44 陽性組的術后生存率較陰性組降低，生存時間縮短CD24 陽性組與陰性組相比差異無統計學意義。CD44+CD24+EPCAM－與EPCAMCD44－CD24－比較差異有統計學意義，其余雙指標組無統計學意義。三指標陽性組與三指標陰性組生存率比較差異有統計學意義(P ＜0.05)，見圖2 ～8。

討 論

本研究同時檢測胃癌組織中的EPCAM、CD44 和CD24 陽性表達，結果顯示EPCAM 表達率在58.95%(56/95)，而國內外學者報道比例在30% ～75%左右［6］。CD44 表達陽性率在43.16%(41/95)，而國內 外報道表達比率在19% ～90%不等［7－8］。CD24表達陽性率58.95%(56/95)，與EPCAM 一致，而此蛋白國內外報道在50% ～81%左右。

表1 95 例胃癌患者Cox 回歸分析Table 1. Cox regression analysis in 95 gastric cancer patients

CD44 與多種腫瘤有關，有學者認為其在結直腸癌中表達高達90%以上，但是陽性組與陰性組在生存率上差異無統計學意義［9］，在小細胞肺癌中患者血清CD44S、CD44V6 水平明顯高于肺良性疾病，可作為鑒別NSCLC 和肺良性疾病的輔助指標［10］。另有學者認為胃癌病例CD24 和CD44v6 表達陽性率明顯高于癌旁組織和不同類型胃良性病變［11］，在胃癌表達陽性率是43.9%，陽性者化療效果好［12］。本研究顯示，CD44 與BORRMANN 分型和WHO 組織學分型和CEA 值有關。同樣，Bektas 等［13］對93 例胃癌組織行CD24 免疫組化分析，認為CD24 表達陽性率在87%，與淋巴血管侵犯、漿膜浸潤和TNM 分期及淋巴結轉移有關。Chou 等［14］認為，CD24 在50%的胃癌細胞質中表達，與TNM 分期、漿膜侵犯和淋巴血管侵犯有關，10 年生存率明顯下降。我們的資料認為CD24 與浸潤深度、腫瘤位置、WHO 組織學分型和臟器侵犯有關(P ＜0.05)。同時我們認為EPCAM 與年齡、腫瘤浸潤深度和WHO 組織學分型有關。年輕或年老、T4期及腺癌患者該指標陽性率

高(P ＜0.05)。EPCAM 與胃癌遠處轉移有較大關系，在遠處轉移、淋巴結轉移及無轉移的胃癌中表達率分別為90%、86%和58%［15］。另外，三指標陽性組與3 指標陰性組在侵潤深度、腫瘤位置、WHO 組織學分型上差異有統計學意義。

表2 EPCAM、CD44 和CD24 在胃癌組織中的表達與臨床病理資料之間的關系Table 2. Correlation between the clinicopathological features and the expression of EPCAM，CD44 and CD24

AC:adenocarcinoma;MC:mucinous carcinoma;SRCC:signet ring cell carcinoma.

Figure 2. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM expression (P ＜0.05).圖2 胃癌中EPCAM 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 3. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with CD44 expression(P ＜0.01).圖3 胃癌中CD44 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 4. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with CD24 expression (P ＞0.05).圖4 胃癌中CD44 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 5. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM，CD44 and CD24 expression (P ＜0.05).圖5 胃癌中EPCAM、CD44 和CD24 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 6. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM and CD44 expression(P ＞0.05).圖6 胃癌中EPCAM 和CD44 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 7. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM and CD24 expression(P ＞0.05).圖7 胃癌中EPCAM 和CD24 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 8. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with CD44 and CD24 expression(P ＜0.05).圖8 胃癌中CD44 和CD24 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

本研究結果顯示，CD44、CD24、EPCAM 在癌旁正常黏膜及腫瘤中均有不同程度表達，但癌旁正常黏膜表達較胃癌組織中低，說明從正常黏膜到癌的轉變過程中三者表達發生了重要變化，可作為預判斷瘤侵襲能力和預后的指標。CD24、EPCAM、三者陽性的表達與浸潤深度有關，而且CD24 還與臟器侵犯有關。同時，三者均與組織學分型有關，多因素分析顯示分化浸潤程度是影響生存最重要的因素，進一步證實了它們與胃癌的浸潤轉移有密切的聯系，對胃癌的預后判斷有一定意義。CD44、CD24 及EPCAM 的表達可能存在著協同作用，或者存在一種機制將其聯合起來，促進腫瘤細胞的浸潤轉移及預后，而且三者聯合作用比任何一種黏附分子單獨作用都更能促進腫瘤的浸潤轉移。EPCAM 與年齡有關，說明它可能與胃癌患者的生存時間縮短有關，年齡上的積累可能與腫瘤干細胞的形成有關。

我們結果顯示，EPCAM、CD44 陽性組與陰性組的生存率差異有統計學意義，而CD24 陽性組與陰性組的生存率差異無統計學意義，這與Bektas 等［13］的結論不同，他們認為CD24 陽性者生存率增加。分析原因，CD44+資料中印戒細胞癌比例較其它兩者高，故與EPCAM 一樣，死亡率高。CD24－病例中T4 占69.23% (27/39)，BORRMANN Ⅲ～Ⅳ占82. 05%(32/39)，與CD24+組比較差異無統計學意義。

綜上所述，聯合檢測EPCAM、CD44 和CD24 可作為胃癌的初篩實驗，尤其對于胃腺癌有診斷價值，同時可指導針對性的手術治療，有益于胃癌的綜合治療，提高生存率。

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