多環芳烴污染對桑園土壤微生物結構及種群多樣性的影響

姜睿玲,楊統一,唐玉斌,陳芳艷 (江蘇科技大學生物與化學工程學院,江蘇 鎮江 212018)

多環芳烴污染對桑園土壤微生物結構及種群多樣性的影響

姜睿玲,楊統一,唐玉斌*,陳芳艷 (江蘇科技大學生物與化學工程學院,江蘇 鎮江 212018)

采用磷脂脂肪酸(PLFAs)分析法和變性梯度凝膠電泳(DGGE)考察了受多環芳烴(PAHs)污染的桑園3個區域的土壤微生物群落結構及種群多樣性的變化.PLFAs分析結果表明,區域2中微生物PLFA總量最高,主要為細菌和真菌;聚類分析揭示,土壤中微生物的PLFAs主要分為3大類群;冗余分析表明,土壤PAHs污染程度對土壤微生物群落結構有一定的影響.DGGE指紋圖譜分析結果顯示,在PAHs污染較高區域,其電泳條帶較多,且3個區域中Shannon指數和Simpson優勢度差異達顯著水平,區域2種群優勢度較高;主成分分析表明,不同區域微生物的種群結構存在顯著性差異.

桑園土壤；微生物多樣性；多環芳烴；PLFAs；PCR-DGGE

多環芳烴(PAHs)是環境中存在的一種典型的持久性有機污染物,許多PAHs具有致癌、致畸、致突變和生物難降解特性[1].開展PAHs污染土壤微生物多樣性的研究,將有助于了解PAHs對土壤微生物群落結構的影響.土壤微生物群落是土壤生態系統的重要組成部分,在環境氣候的形成、地球化學循環、地質演化和生物進化中扮演著重要角色[2].近年來,土壤受到的污染日益嚴峻,這對土壤微生物多樣性造成嚴重威脅[2-3].目前,不依賴分離培養的微生物研究方法,為土壤微生物研究提供了新的技術,包括生物標記法和分子生物學方法等.磷脂脂肪酸(PLFAs)是生物體細胞膜的主要組成成分之一,是存活微生物的生物標記,細胞死亡后數分鐘到數小時內磷脂化合物會迅速分解,且不同類群的微生物具有特異的脂肪酸[4-5].因此,土壤 PLFAs組成和含量的變化在一定程度上可以反映土壤中存活的微生物群落結構及其數量的動態變化[6].另外,近年來基于16S rRNA的變性梯度凝膠電泳(DGGE)等分子生物學技術在表征微生物群落遺傳多樣性方面發揮著愈來愈重要的作用.其中PCR-DGGE在微生物群落多樣性和種群動態檢測中得到廣泛應用[7].

研究表明,土壤微生物活性和群落功能多樣性受到土壤質地和植物種類組成的影響[8].目前,關于桑園土壤微生物多樣性的研究鮮有報道,本研究分別采用PLFAs和PCR-DGGE技術從不同的層面分析PAHs復合污染對桑園土壤微生物群落結構及種群多樣性的影響,為生態桑園的建設提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

供試土樣于2011年5月取自江蘇省鎮江市某路域桑園.沿公路一側垂直于公路設置3個取樣區域,第一個采樣點距離公路50m.每個區域間隔150～200m(圖1).各區域均采用正方形5點法取樣,將每個區域的5個點的土樣混合在一起,構成一個區域的一次采集的混合土樣,每個區域分別按照這種方法取 3個重復樣,3個區域共取 9個混合土樣(重復樣).取土深度為0～20cm,各處理混合均勻后除去砂礫和動植物殘體,一部分凍干后于-20℃下保存,隨后進行土壤微生物 PLFAs的提取和測試分析;另一部分直接在-20℃下保存,以備進行分子生物學實驗.

圖1 某路域桑園示意Fig.1 Schematic diagram of road-side mulberry orchard

此桑園 3個區域的土壤成土母質是石英砂巖、古代沉積巖、頁巖的風化物.3個區域土樣的理化性質見表1.

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 Physical and chemical properties of the soil tested

因桑園靠近高速公路,常年受汽車尾氣影響,汽車尾氣中的PAHs可通過空氣沉降作用進入土壤中.除圖1所示的高速公路外,還有一條與圖1所示公路相垂直、在桑園右側(向北看)與桑園邊緣相距200m左右的公路,也對桑園土壤的PAHs污染有所貢獻.此外,桑園土壤中的PAHs還可能來源于附近大橋上汽車尾氣以及郊區居民對稻麥草的焚燒等其他途徑.3個區域共檢測到15種PAHs,分別為:NAP (萘)、ACY(苊烯)、FLU(芴)、PHE(菲)、ANT(蒽)、FLT (熒蒽)、PYR(芘)、CHR ()、BaA (苯并[a]蒽)、BbF (苯并[b]熒蒽)、BkF (苯并 [k]熒蒽)、BaP (苯并[a]芘)、IPY (茚苯(1,2,3-cd)芘)、DBA (二苯并(a, n)蒽)、BPE (苯并(ghi)苝(二萘嵌苯)).監測結果表明,區域2可能處于 PAHs最佳沉降點,其 PAHs總含量最高(3.469mg/kg),區域3次之(0.933mg/kg),區域1最低(0.637mg/kg).

1.2 PLFAs生物標記分析方法

土壤微生物群落結構分析采用磷脂脂肪酸分析法.PLFAs的提取和測定參照 Bligh[9]方法并略作修改.步驟為:稱6g土樣加20mL脂類提取液(V氯仿:V甲醇:V檸檬酸緩沖液=1:2:0.8),250r/min避光振蕩4h,以4500r/min離心并取上清液,重復操作,合并上清液,加8mL氯仿和8mL檸檬酸緩沖液,靜置過夜.取 5mL下層溶液,氮氣吹干后加1mL氯仿.過硅膠柱,含磷脂的極性脂類用 5mL甲醇洗,洗液吹干后溶于1mL甲醇+甲苯混合液(體積比1:1),加1mL 0.2mol/L KOH,水浴.依次加2mL正己烷,0.3mL 1mol/L醋酸,2mL去離子水.以4500r/min的速率離心并收集上層液,吹干后溶于 200μL含內標(C19:0)的正己烷中,轉入1.5mL進樣瓶中,-20℃冰箱中避光保存,備GC-MS分析.

采用美國Agilent 6850型氣相色譜儀,包括全自動進樣裝置、石英毛細管柱及氫火焰離子化檢測器.分離柱為Agilent 19091B-102E超25%苯基甲基硅氧烷25.0m×200μm×0.33μm柱.進樣口溫度250℃,程序升高柱溫:起始170℃,以5℃/min升高到260℃,再以40℃/min升高到310℃,保持1.5min.后運行170℃保持1.5min.載氣為氦氣,分離比為 100:1.進樣量為 2mL.PLFAs的鑒定采用美國MIDI公司(MIDI,Newark,Delaware,USA)開發的基于細菌細胞脂肪酸分析鑒定的 Sherlock MIS 4.5系統.

磷脂脂肪酸的系統命名,以總碳數:雙鍵數和雙鍵距分子末端位置命名,i和a分別表示支鏈的異構和反異構,c和t分別表示雙鍵的順式和反式結構,cy表示環丙基脂肪酸,10Me表示一個甲基在距分子末端第10個碳原子上[10].不同的生物標記代表著不同類型的微生物.根據現在已有的研究結果[11],本研究以 i11:03OH、12:00、13:0 2OH、14:1 w5c、i15:1 G、i15:0、a15:0、15:00、i15:0 3OH、i16:0、a16:0、16:00、a17:0、i17:0 3OH、cy17:0、18:00、cy19:0 w8c和16:0 N alcohol作為細菌特定脂肪酸;其中革蘭氏陽性菌(G+)以i15:0、a15:0、i16:0、a16:0、a17:0和16:0 N alcohol表示;革蘭氏陰性菌(Gˉ)以 i17:0 3OH 和 cy17:0表示;放線菌以 10 Me18:0,TBSA 表示;真菌源脂肪酸以 18:3ω6c (6,9,12)和18:1 w9c表示[12].

1.3 土壤DNA提取及16S rRNA可變區的PCR擴增

DNA提取采用美國Mobio強力土壤DNA提取試劑盒(PowerSoil? DNA Isolation Kit).采用細菌的 16S rDNA通用引物對稀釋后的土壤總DNA進行擴增.引物序列是:338F:5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3;534R:5-GCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCG GCT GCTGG-3.PCR反應采用50μL擴增體系,包括:10×PCR Buffer 5μL, dNTP混 合 物 (各 2.5mmol/L) 4μL,引 物 338F (20μmol/L)1μL,引物 534R(20μmol/L) 1μL,模板DNA 2.5ng,TaKaRa rTaq (5U/μL) 0.25μL,ddH2O補至 50μL.PCR反應條件為:94℃ 1 0min,94℃變性1min,55℃退火1min (每個循環降低0.1℃), 72℃延伸1min 30s,共30個循環,最終72℃延伸10min. PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.

1.4 PCR產物的變形梯度凝膠電泳分析

采用美國 Bio-Rad 公司 The DcodeTMUniversal Mutation Detection System進行變形梯度凝膠電泳.采用 8%膠濃度,變形范圍為 30%～60%,電泳條件為150V,時間420min.電泳結束后采用銀染染色.

1.5 數據處理與統計分析

PLFAs數據用Microsoft Excel 2003處理;方差分析、主成分分析及聚類分析等多元統計分析用軟件 SPSS18.0完成;利用 Quantity One軟件(Bio-Rad)對DGGE圖譜進行數字化處理;采用平均距離法 (UPMGA)聚類分析;選用 Shannon指數(H)、Shannon均勻度(E)和Simpson優勢度(D)表征土壤微生物狀態.

式中:Pi為第i個DGGE條帶的灰度占每個泳道總條帶灰度的比率;S為DGGE條帶總數.

2 結果與討論

2.1 PLFAs生物標記種類數及含量的變化

桑園3個區域土樣中共檢測到22種PLFAs,不同的生物標記代表不同類型的微生物,其在不同區域土壤中的分布有所差異(圖2).

圖2 PLFAs圖譜Fig.2 PLFAs spectrum of graph of the tested soils

由圖2可知, cy17:0僅出現在區域3中,而i16:0只出現在區域2和區域3中,同時,區域3中沒有i11:0 3OH,而區域2中沒有18:0和10Me 18:0;其余的17種PLFAs在3個區域中均有不同濃度的分布.總體而言,不同區域的 16:0、18:1w9c、a16:0、i20:0、a15:0含量均較多,共占總PLFAs含量的58.85%.研究表明脂肪酸 16:0可代替總PLFAs表征土壤總微生物量[13],3個區域中16:0濃度:區域2＞區域1＞區域3,由此可見, PAHs污染嚴重的區域,其微生物總量較高,這可能是因為PAHs為土壤微生物提供了豐富的碳源,刺激了微生物的活性,使其代謝旺盛,生長繁殖速度較快.當然,也可能與區域2有機質和氮的含量偏高有關.

2.2 不同濃度 PAHs對土壤微生物群落結構的影響

土壤中細菌、真菌、放線菌含量反映土壤微生物的區系結構[14].由圖3可發現,受PAHs污染最嚴重區域,其土壤中細菌、真菌含量較高,不含放線菌.其中,細菌中革蘭氏陽性菌含量最高,而受PAHs污染較為嚴重區域革蘭氏陰性菌含量最高.通過方差分析發現,不同濃度的PAHs對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌均有顯著影響.對于革蘭氏陽性菌:區域 2＞區域 1＞區域 3,說明PAHs能特異性地刺激土壤革蘭氏陽性菌的生長.對于革蘭氏陰性菌:區域3＞區域2＞區域1,表明較高濃度 PAHs不利于革蘭氏陰性菌的生長,適當濃度的PAHs對革蘭氏陰性菌的生長具有刺激作用.而對于真菌:區域2＞區域1＞區域3.整體來看,土壤中檢測到的放線菌PLFAs最少,區域2中未檢測到放線菌,表明在較高濃度 PAHs污染的土壤中,放線菌在生存競爭中處于劣勢.

圖3 不同區域土壤微生物的群落結構Fig.3 Microbial community structure of soil samped from different area

2.3 土壤微生物群落PLFAs的聚類分析

聚類分析結果如圖4所示,當歐式距離為10時,不同區域土壤微生物的PLFAs被分成三個大類群.類型Ⅰ包括磷脂脂肪酸i11:0 3OH、12:0、i15:1G、13:02OH、14:1w5c、16:0N alcohol、18:0、 18:3w6c(6,9,12)、i15:0、cy17:0、10Me18:0、i16:0和cy19:0 w8c,此類群特征是:在3區域中含量都較低,而且有些PLFAs只在某2個區域甚至某1個區域中存在;類群Ⅱ包括磷脂脂肪酸 a15:0、a17:0、i20:0、i15:0 3OH、a16:0、18:1w9c、16:0,其特征是這些磷脂脂肪酸在 3個區域中均有分布且含量較高;類群Ⅲ包括磷脂脂肪酸 i17:0 3OH,它是區域3中含量最高的磷脂脂肪酸.

圖4 桑園土壤微生物群落的PLFAs聚類分析Fig.4 Cluster analysis of PLFAs of microbial community in mulberry orchard soil

2.4 土壤微生物PLFAs與環境因子關系的冗余分析

冗余分析(RDA)顯示不同區域微生物PLFAs與PAHs之間的關系(圖5).由圖5可知,從區域上分析,區域1和區域3的差異較小,而與區域2的差異較大.區域1在RDA1上比較分散,正負半軸均有分布,而區域2集中在RDA1的正半軸,區域 3分布在 RDA1的負半軸.從區域和PAHs的關系來看,區域2與絕大多數PAHs成正相關,且與FLU相關性最高,只與BPE和PRY成負相關,這與檢測出區域2中PAHs濃度最高相一致.區域1與PAHs相關性最小.從土壤微生物的PLFAs與PAHs的關系來看,細菌PLFAs總濃度與絕大多數PAHs有正相關性,與FLU呈顯著正相關性;而真菌PLFAs總濃度與FLT、ACE、ANT和 ACY呈正相關性且相關性較大,而與其他PAHs相關性較小;放線菌 PLFAs總濃度只與PYR和 BPE呈正相關性且相關性較小,與其余PAHs均成負相關性.從土壤微生物的PLFAs與區域來看,區域2與細菌PLFAs總濃度呈顯著正相關性,區域3與放線菌PLFAs總濃度呈顯著正相關性.總的來說,區域2中的細菌受到PAHs的影響最大,其次是真菌.

圖5 區域與環境因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of regional and environmental factors

2.5 DGGE圖譜分析

對3個區域9個樣品的PCR擴增產物進行DGGE分析(圖6).從圖6可見,3個區域中總條帶數為區域2＞區域3＞區域1,結合區域中PAHs含量發現,較高的 PAHs有利于土壤微生物多樣性提高.萬春黎等[15]研究石油污染土壤中細菌群落結構特征時發現,未受石油污染的土樣中,能檢測到的微生物群落條帶較少,這與本文的研究結果一致.不同區域土樣分離出來的條帶不一樣,其中條帶 2、5、9、10、22、26、27、28、29、30和31為3個區域共有條帶,而條帶3和7是受PAHs污染相對較嚴重的區域2所特有條帶. 這可能由于土壤中細菌能利用 PAHs作為其碳源,且許多細菌開始降解 PAHs,隨著時間的推移,逐漸成為該區域土壤中的優勢菌.因此條帶 3和 7可能對應的是土壤中PAHs的高效降解菌株.

2.6 桑園土壤微生物群落多樣性指數分析

多樣性指數Shannon指數(H)、Shannon均勻度(E)和Simpson優勢度(D)是從不同角度反映土壤微生物群落結構特征的度量值,它們可以反映群落類型的不同,群落結構的差異,群落演替的動態變化[16].根據DGGE圖譜,分別計算Shannon指數、Shannon均勻度和Simpson指數(表2).

圖6 不同土壤樣品的DGGE圖譜Fig.6 DGGE fingerprint of microbial communities of different soil samples

表2 桑園土壤微生物群落多樣性指數Table 2 Diversity index of microbial community in mulberry orchard soil

由表2可知,多樣性指數H和均勻度E為區域3＞區域2＞區域1,而優勢度D為區域2＞區域3＞區域1.這可能由于長期受PAHs污染的情況下,污染程度相對較低的區域3中,其土壤中細菌更適應該種生態條件,從而導致種群數量相對較高,而PAHs污染相對較嚴重的區域2,其土壤中細菌利用PAHs作為碳源,隨著時間的推移,許多細菌開始逐漸降解 PAHs,繁殖并成為該區域的優勢菌種,因此區域2種群優勢度較高.當然,區域2種群優勢度較高,也可能和區域2土壤氮素較高有關.Shannon均勻度表明PAHs對土壤微生物的均勻度影響差異不顯著.朱艷華等[17]研究指出低濃度原油增加了微生物生物量,而高濃度產生抑制作用,原油污染存在中等濃度效應;高濃度原油污染土壤“優勢群體”豐富度較高,即群落區域單一化.而原油中含有豐富的 PAHs,其研究結果與本研究一致.

2.7 DGGE圖譜的主成分分析

主成分分析可比較微生物群落種群多樣性差異的大小,根據DGGE圖譜,對不同區域的土壤微生物類群進行主成分分析,得到 2個主成分PC1和 PC2,它們分別解釋了總變異的61.6%和25.9%(圖7).

圖7 DGGE圖譜的主成分分析Fig.7 Principal components analysis of DGGE profiles

由圖7可看出,區域2和區域3分布在PC1的負方向,區域 1在 PC1的正負方向均有分布;區域2分布在PC2的正方向,而區域1和區域3分布在PC2的負方向.區域3在PC1上的得分值最低,其次為區域2,且兩區域的得分值較接近,而區域1在PC1上的得分值較高且有很好的分離.總體來看,PAHs污染程度不同的區域其土壤微生物DGGE條帶有較大差異.

3 結論

3.1 在不同程度的PAHs污染下,3個區域土壤的微生物群落結構發生了明顯變化,不同區域土壤微生物的PLFAs可根據不同特征分成3個大類群.

3.2 PAHs污染能顯著改變土壤中細菌的結構多樣性,區域 2中細菌(革蘭氏陽性菌)和真菌含量較高.DGGE圖譜表明3和7是區域2特有條帶,可能是降解PAHs的優勢菌種.

3.3 多樣性指數分析表明, PAHs污染存在中等濃度效應, 細菌能利用PAHs作為碳源,并逐漸降解PAHs,形成優勢種群.

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Effect of PAHs pollution on microbial structure and population diversity of mulberry orchard soil.

JIANG Rui-ling, YANG Tong-yi, TANG Yu-bin*, CHEN Fang-yan (School of Biology and Chemical Engineering, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212018, China). China Environmental Science, 2012,32(9)：1655～1661

Phospholipid fatty acids (PLFAs) analysis method and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technology were used to investigate microbial structure and population diversity of the soil sampled from the three areas of the mulberry orchard, which was contaminated by polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). The results of PLFAs analysis showed that total PLFA biomass of the microbes in area 2 was the highest, most of which were the bacteria and fungi. Clustering analysis of soil microbes revealed that the PLFAs were mainly divided into three groups. Redundancy analysis demonstrated that PAHs pollution degree had a certain effect on soil microbial community structure. DGGE fingerprint analysis showed that there were more electrophoresis bands in the areas with higher PAHs contamination, and the difference of Shannon index and Simpson dominance degree were significant among three areas. Population dominance degree of the soil in area 2 was the highest. Principal components analysis of DGGE profiles indicated that there were significant differences in population structure of the microbes in different area.

mulberry field soil；microbial diversity；PAHs；PLFAs；PCR-DGGE

2012-02-06

江蘇省自然科學基金項目(BK2009726);江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(CXZZ11_0274)

* 責任作者, 教授, ybbill@163.com

X171.5, S154.36

A

1000-6923(2012)09-1655-07

姜睿玲(1986-),女,黑龍江青岡縣人,江蘇科技大學碩士研究生,主要從事環境微生物及其生態學研究.發表論文3篇.