反硝化菌株GW1的篩選及特性研究

李海波，廉 靜，李 敏，陳建榮，趙麗君，姜宗姍，許志芳，王曉磊，郭建博

（河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018）

反硝化菌株GW1的篩選及特性研究

李海波，廉 靜，李 敏，陳建榮，趙麗君，姜宗姍，許志芳，王曉磊，郭建博

（河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018）

研究利用反硝化培養(yǎng)基，從實(shí)驗(yàn)室厭氧反硝化顆粒污泥中分離、篩選出1株反硝化優(yōu)勢(shì)菌株GW1，通過16SrDNA序列分析對(duì)其初步鑒定，并研究了溫度、pH值、碳源、碳氮比和硝酸鹽氮質(zhì)量濃度對(duì)菌株GW1反硝化特性的影響。研究結(jié)果表明，菌株GW1的16SrDNA基因序列與Paracoccusversutus有最大相似性，達(dá)到99.9%，Genebank登錄序列號(hào)為GU111570；分離菌株呈革蘭氏陽(yáng)性；最佳反硝化條件：丁二酸鈉為碳源，溫度為35～40℃，pH值為7.0～8.0，建議工程應(yīng)用碳氮比為3∶1（質(zhì)量比）。該菌株特性的研究為解決反硝化速率過慢問題提供了技術(shù)支持。

反硝化細(xì)菌；16SrDNA；篩選；生物脫氮

近年來，含氮工業(yè)廢水的大量排放及農(nóng)業(yè)氮肥的過量施用，導(dǎo)致硝酸鹽污染廣泛存在于地下水及地表水中。在飲用水中，硝酸鹽氮及其衍生產(chǎn)物具有致病、致癌作用而影響人類健康；含氮廢水進(jìn)入水體可引起受納水體的富營(yíng)養(yǎng)化［1－2］。硝酸鹽氮污染已成為許多國(guó)家和地區(qū)所面臨的一個(gè)重要環(huán)境問題［3－5］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)含硝酸鹽氮廢水的處理方法主要可分為物化法和生物法2大類。物化法如離子交換法和反滲透膜法等，這些方法運(yùn)行費(fèi)用高且會(huì)產(chǎn)生二次污染，使其在處理廢水的實(shí)際應(yīng)用中具有一定局限性［6－8］。生物脫氮技術(shù)解決了物化法中運(yùn)行費(fèi)用較高的問題，而且不會(huì)造成二次污染。傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)主要包括硝化和反硝化2個(gè)過程，其中反硝化作用在厭氧或兼氧條件下進(jìn)行，是脫氮作用的限速步驟。因此提高反硝化過程速率成為目前生物脫氮研究的熱點(diǎn)之一。而培養(yǎng)和篩選高效反硝化菌（群）是解決此問題的有效途徑［9－11］。

本研究從定向馴化的厭氧反硝化顆粒污泥中分離出1株高效反硝化菌株，通過16SrDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，并考察溫度、pH值、碳源、碳氮比和硝酸鹽氮質(zhì)量濃度對(duì)反硝化特性的影響，為其在含氮廢水處理中的實(shí)際應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 污泥來源

所用厭氧反硝化顆粒污泥，是由某淀粉廠UASB厭氧反應(yīng)器顆粒污泥經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室定向反硝化馴化后得到的。

1.2 培養(yǎng)基

1）分離培養(yǎng)基為溴百里酚藍(lán)富集培養(yǎng)基［12］：KNO3（1g／L），KH2PO4（1g／L），F(xiàn)eCl2·6H2O（0.5g／L），MgSO4·7H2O（1g／L），CaCl2·7H2O（0.2mg／L），琥珀酸鈉（8.5g／L），瓊脂（20g／L），1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溴百里酚藍(lán)（15g／L），用1mol／L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0，于121℃滅菌25min。

2）富集培養(yǎng)基：丁二酸鈉（1.447g／L），NaNO3（1.214g／L），KH2PO4（0.013 2g／L），MgSO4（0.12 g／L），酵母粉（0.5g／L），胰蛋白胨（1.5g／L）和微量元素（2mL／L），用1mol／L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0，于121℃滅菌25min。

3）反硝化培養(yǎng)基：KH2PO4（0.013 2g／L），MgSO4（0.12g／L），微量元素（2mL／L），NaNO3、丁二酸鈉和pH值根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件而定，用1mol／L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0，于121℃滅菌25min。

4）微量元素組成：EDTA二鈉鹽（63.68mg／L），ZnSO4（2.2mg／L），CaCl2（5.5mg／L），MnSO4（4.32 mg／L），F(xiàn)eSO4·7H2O（5.0mg／L），Na2MoO4·2H2O（2.11mg／L），CuSO4·5H2O（1.57mg／L）和CoCl2· 6H2O（1.61mg／L）。

1.3 反硝化菌株GW1的分離及純化

從厭氧反硝化顆粒污泥中取出50mL泥水混合物，將顆粒污泥研磨后，取10mL混合物接種于富集培養(yǎng)基中。置于空氣搖床上，于35℃，120r／min振蕩培養(yǎng)，24h后得到富集菌液，以10倍濃度梯度逐步進(jìn)行稀釋一直到原有濃度的10－8，分別吸取各稀釋度菌液0.1mL至分離培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，30℃下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，出現(xiàn)顯著菌落。挑取培養(yǎng)基上出現(xiàn)藍(lán)色暈圈的単菌菌落作為初篩菌，并將其接種于富集培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。將初篩菌按5%的接種量（100mL液體培養(yǎng)基接種660mm處OD值為1.0左右的菌液5 mL，后面液體接種量相同）接種在反硝化培養(yǎng)基中，120r／min，35℃，培養(yǎng)15h得到反硝化細(xì)菌菌液。

1.4 反硝化菌株GW1的形態(tài)觀察及鑒定

將篩選出的反硝化細(xì)菌GW1接種到反硝化培養(yǎng)基，35℃，120r／min培養(yǎng)15h，所得菌液用于革蘭氏染色。同時(shí)，從平板上挑取單菌，進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取菌株總DNA，并以此為模板，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將回收產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，將反硝化菌株GW1在Genebank進(jìn)行登記，其序列號(hào)為GU111570，序列在Genebank上進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.5 反硝化菌株GW1的反硝化特性研究

在250mL錐形瓶中加入270mL滅菌后的反硝化培養(yǎng)基，按體積比5%接種預(yù)配養(yǎng)15h的接種液，加橡膠塞密封后放入培養(yǎng)箱。使初始細(xì)菌濃度660nm處OD值控制在0.1左右，考察反硝化菌株GW1在不同溫度、pH值、硝酸鹽氮質(zhì)量濃度、碳源和碳氮比下對(duì)硝酸鹽氮的降解情況，及不同初始硝酸鹽氮質(zhì)量濃度對(duì)菌株的影響，確定反硝化菌株GW1的最佳降解硝酸鹽氮的條件。

1.6 分析項(xiàng)目及方法

1）菌體生長(zhǎng)量測(cè)定 微生物濃度采用660nm處OD值表示，紫外分光光度法測(cè)定（上海天美UV－2600紫外分光光度計(jì)）。

2）硝酸鹽氮質(zhì)量濃度測(cè)定 采用紫外分光光度法（上海天美UV－2600紫外分光光度計(jì)）［13］。

2 結(jié)果與討論

2.1 反硝化細(xì)菌GW1形態(tài)觀察和鑒定

從厭氧反硝化顆粒污泥中分離、篩選出的1株優(yōu)勢(shì)反硝化菌，在利用丁二酸鈉為碳源，水浴恒溫35℃，培養(yǎng)基pH值為7.0，初始硝酸鹽質(zhì)量濃度為230mg／L條件下，6h后硝酸鹽去除率為87%，見圖1a）。因而選此菌為考察對(duì)象，考察其反硝化特性，并將其命名為GW1。菌株GW1的菌落呈白色突起狀，表面光滑無褶皺，其具體外部形態(tài)見圖1b），將細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡100倍油鏡下觀察，GW1單菌形態(tài)見圖1c）。

圖1 反硝化細(xì)菌菌落形態(tài)特征Fig.1 Colony morphology of the strains separated from anaerobic denitification sludge

圖1c）表明，菌株GW1在進(jìn)行革蘭氏染色后呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌；細(xì)菌呈球形，為球菌。該細(xì)菌16SrDNA堿基數(shù)為1 416bp，反硝化菌株GW1序列（Genebank登錄序列號(hào)為GU111570），與Paracoccusversutus相似性達(dá)到99.9%，菌株GW1為脫氮副球菌，系典型的反硝化細(xì)菌。

2.2 菌株GW1反硝化特性研究

考慮到影響菌株GW1反硝化作用的因素，實(shí)驗(yàn)分別從溫度、pH值、硝酸鹽氮質(zhì)量濃度、碳源、碳氮比等方面考察了菌株GW1的反硝化特性。

2.2.1 溫度和pH值對(duì)菌株GW1反硝化作用的影響

溫度和pH值是影響微生物活性的重要因素，對(duì)于某一種特定的微生物，它只能在特定的溫度和pH值條件下進(jìn)行生命代謝活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)采用丁二酸鈉為碳源、碳氮比為6∶1（質(zhì)量比，下同）、初始硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為310mg／L和pH值為7.0的反硝化培養(yǎng)基。分別考察了20，25，30，35，40，45，50℃下菌株GW1的反硝化特性，反應(yīng)過程中體系的硝酸鹽氮質(zhì)量濃度的變化見圖2。圖2表明，在不同溫度下，菌株GW1反硝化速率不同，溫度為35℃和40℃時(shí)，菌株GW1的硝酸鹽氮的降解速率非常快，在反應(yīng)進(jìn)行4h后，硝酸鹽氮質(zhì)量濃度從310mg／L迅速降到100mg／L以下，溫度低于30℃后反硝化速率開始減慢，溫度為20℃時(shí)4h的硝酸鹽氮去除率不到15%，速率明顯降低。反應(yīng)溫度超過40℃后，硝酸鹽氮降解速率變小，這說明高溫可能影響了菌株GW1反硝化酶的活性，從而使反硝化反應(yīng)速率降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株GW1反硝化適宜溫度范圍為35～40℃。

采用丁二酸鈉為碳源、碳氮比為6∶1的反硝化培養(yǎng)基，分別考察了pH值為5.0，6.0，7.0，7.5，8.0和9.0時(shí)對(duì)菌株GW1反硝化過程中硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化的影響，見圖3。圖3表明，在不同pH值條件下，菌株GW1的反硝化速率不同。當(dāng)反應(yīng)體系pH值為7.0～8.0時(shí)，硝酸鹽氮的降解速率最快。反應(yīng)進(jìn)行4h后，硝酸鹽氮質(zhì)量濃度從310mg／L迅速降到80mg／L左右。當(dāng)反應(yīng)體系pH值低于7.0時(shí)，細(xì)菌反硝化速率明顯降低，pH值在5.0時(shí)反應(yīng)體系硝酸鹽不降解，pH值在9.0時(shí)反硝化速率略有降低。因此，菌株GW1反硝化過程中適宜pH值范圍為7.0～8.0。

2.2.2 硝酸鹽氮質(zhì)量濃度對(duì)菌株GW1反硝化速率的影響

采用丁二酸鈉為碳源、碳氮比為6∶1，溫度為38℃，pH值為7.0的反硝化培養(yǎng)基，分別考察了初始硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為100，200，300，400，500，600，800mg／L對(duì)菌株GW1反硝化速率的影響，見圖4。

圖4表明，硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為800mg／L時(shí)，在反應(yīng)開始后的2h，體系反硝化速率很低，說明高質(zhì)量濃度的硝酸鹽氮對(duì)反硝化細(xì)菌造成一定抑制，隨后細(xì)菌適應(yīng)后，系統(tǒng)反硝化速率加快。硝酸鹽氮質(zhì)量濃度較高時(shí)，反硝化反應(yīng)速率較低，可能是因?yàn)橄跛猁}氮質(zhì)量濃度過高影響反硝化細(xì)菌細(xì)胞滲透壓和其他生命活動(dòng)，反硝化酶活動(dòng)不能正常發(fā)揮功能，經(jīng)過馴化適應(yīng)后，反硝化速率得以正常進(jìn)行。

硝酸鹽氮質(zhì)量濃度與反硝化速率常數(shù)的關(guān)系曲線，見圖5。圖5表明，在實(shí)驗(yàn)所選的硝酸鹽氮質(zhì)量濃度（100～600mg／L）下基質(zhì)濃度為限制反硝化速率的主要影響因素，降解方程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

2.2.3 碳源對(duì)菌株GW1反硝化作用的影響

生物反硝化過程中，碳源的種類對(duì)微生物的反硝化速率起著關(guān)鍵的作用。本實(shí)驗(yàn)采用碳氮比為6∶1、初始硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為200mg／L、溫度為38℃和pH值為7.0的反硝化培養(yǎng)基，分別考察了以蔗糖、乳糖、檸檬酸鈉、丁二酸鈉、葡萄糖、甲醇和混合碳源（酵母粉、胰蛋白胨）為碳源時(shí)，對(duì)菌株GW1的反硝化作用的影響。不同碳源下反硝化體系硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化見圖6。

圖6表明，不同碳源對(duì)GW1反硝化作用影響不同，丁二酸鈉為碳源時(shí)細(xì)菌反硝化速率最高，5h硝酸鹽氮降解率達(dá)94.2%。檸檬酸鈉為碳源時(shí)硝酸鹽氮降解緩慢，因此，檸檬酸鈉最不適合作為碳源。

2.2.4 碳氮比對(duì)菌株GW1反硝化作用的影響

采用丁二酸鈉為碳源，溫度為38℃，pH值為7.0的反硝化培養(yǎng)基。分別考察了碳氮比為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，6∶1，8∶1和10∶1時(shí)，對(duì)細(xì)菌GW1反硝化的影響，見圖7。

圖7表明，低碳氮比時(shí)，細(xì)菌反硝化速率較低，而且由于碳源不足，不能將所有的硝酸鹽還原。碳氮比越大，細(xì)菌反硝化速率越高，當(dāng)碳氮比達(dá)到3時(shí)，硝酸鹽氮降解基本完全。當(dāng)碳氮比達(dá)到6∶1時(shí)，細(xì)菌反硝化速率達(dá)到最大，再增加碳氮比對(duì)菌株GW1的反硝化速率影響較小。因此菌株GW1反硝化過程中的最適宜碳氮比為6∶1。但碳氮比高通常會(huì)增加反硝化費(fèi)用，而在6h后碳氮比為3∶1時(shí)硝酸鹽氮降解也比較完全，而且反硝化反應(yīng)速率與碳氮比為6∶1時(shí)相差不大，因此建議工程上控制碳氮比為3∶1。

3 結(jié) 論

從厭氧反硝化顆粒污泥中，篩選了1株反硝化菌株GW1，水中初始硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為230mg／L時(shí)，6h硝酸鹽氮去除率為87%，能夠有效去除水中硝酸鹽氮，通過對(duì)菌株GW1的形態(tài)觀察、革蘭氏染色、16SrDNA分子鑒定，并對(duì)菌株GW1反硝化溫度、pH值、碳源、碳氮比和硝酸鹽氮質(zhì)量濃度等影響因素進(jìn)行考察，確定出菌株GW1的最佳反硝化條件。結(jié)論如下：

1）GW1的菌落呈白色、圓形、邊緣整齊、縱剖面隆起，革蘭氏陽(yáng)性菌；通過鑒定，確定GW1與脫氮副球菌Paracoccusversutus有最大相似度，菌株GW1在Genebank的登錄的序列號(hào)為GU111570。

2）菌株GW1的反硝化適宜pH值范圍為7.0～8.0，反應(yīng)溫度為35～40℃，最佳碳源為丁二酸鈉，以丁二酸鈉為碳源時(shí)最適碳氮比為6∶1，為節(jié)省費(fèi)用，建議工程上應(yīng)用碳氮比為3∶1；在所選的硝酸鹽氮質(zhì)量濃度條件下，反硝化細(xì)菌GW1能夠直接承受的硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為600mg／L。

［1］ KLEINJANS J C，ALBERING H J，MARX A，et al.Nitrate contamination of drinking water：Evaluation of genotoxic risk in human population［J］.Environmental Health Perspectives，1991，94（8）：89－193.

［2］ 范 彬，曲久輝，劉鎖祥，等.飲用水中硝酸鹽的脫除［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備（Technigues and Equipment for Environmental Pollution Control），2000，1（3）：44－50.

［3］ MANDPI M A，ELLOITT D J，MEMENY－MAZDK A.Denitrification of groundwater using acetic acid as a carbon source［J］.Water Science and Technology，1999，40（2）：53－59.

［4］ GREEN M，SCHNIZER M，TARRE S，et al.Groundwater denitrification using an upflow sludge blanket reactor［J］.Water Research，1994，28（3）：631－637.

［5］ LIN Y F，JING S R，WANG T W，et al.Effects of macrophytes and external carbon sources on nitrate removal from groundwater in constructed wetlands［J］.Environmental Pollution，2002，119（3）：413－420.

［6］ HOA T T H，KHANH L N，LIU Z J，et al.Nitrogen removal by immobilized anammox sludge using PVA gel as biocarrier［J］.Japanese Journal of Water Treatment Biology，2006，42：139－149.

［7］ 趙 昕，夏文香，陳麗麗，等.海水反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)及性能研究［J］.生物技術(shù)（Biotechnology），2010，20（4）：75－77.

［9］ 蔡昌鳳，梁 磊.高效好氧反硝化細(xì)菌的篩選及脫氮特性的研究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)（Environmental Science ＆Technology），2011，34（1）：41－44.

［10］ 胡朝松，李春強(qiáng)，劉志昕，等.海洋沉積物中反硝化細(xì)菌的分離鑒定及反硝化性能研究［J］.環(huán)境科學(xué)研究（Research of Environmental Sciences），2009，22（1）：114－118.

［11］ TAKAYA N，CATALAN－SAKAIRI M A B，SAKAGUCHI Y，et al.Aerobic denitrification bacteria that produce low levels of nitrous oxide［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（6）：3 152－3 157.

［12］ 國(guó)家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法［M］.第4版.北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002.

Isolation and characteristics of denitrifying bacterium strain GW1

LI Hai－bo，LIAN Jing，LI Min，CHEN Jian－rong，ZHAO Li－jun，JIANG Zong－shan，XU Zhi－fang，WANG Xiao－lei，GUO Jian－bo
（College of Environmental Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018，China）

A highly active denitrifier named GW1was isolated from the denitrification granule sludge，and 16SrDNA identification of the strain was performed.Influencing factors such as temperature，pH，carbon source and C／N ratio were optimized through batch experiments，and the effect of nitrate concentration on the denitrification was also studied.The phylogenetic analysis based on 16SrDNA suggests that strain GW1is the closest relative of Paracoccus versutus with 99.9% sequence similarity and high homology.Genbank sequence number is GU111570.Strain GW1is Gram－positive.The optimal conditions for the denitrification by strain GW1are sodium succinate as carbon source，temperature 35～40℃，pH（7.0～8.0）and proposed project use of C／N ratio 3，respectively.Strain GW1can remove nitrate effectively.The study may help solve the problem of slow denitrifying rate.

denitrifying bacteria；16SrDNA；isolation；biological nitrogen removal

X703

A

1008－1542（2012）02－0184－06

2011－10－24；責(zé)任編輯：王海云

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（50978082）；2010年教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”（NCET－10－0127）

李海波（1985－），男，山東廣饒人，碩士研究生，主要從事水污染控制方面的研究。

郭建博教授。E－mail：jianbguo＠163.com