艾灸足三里等穴誘導HSP60對急性胃黏膜損傷大鼠Smac表達的影響

郁 潔，彭 宏，林亞平，易受鄉(xiāng)

（湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208）

艾灸足三里等穴誘導HSP60對急性胃黏膜損傷大鼠Smac表達的影響

郁 潔，彭 宏，林亞平，易受鄉(xiāng)

（湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208）

目的 觀察艾灸足陽明胃經(jīng)“足三里”等穴對急性胃黏膜損傷模型大鼠HSP60、Smac表達的影響，探討艾灸足陽明經(jīng)穴抗胃黏膜損傷的保護性機制。方法 24只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、艾灸穴位組，8只/組。大鼠艾灸預處理8 d，進行無水乙醇灌胃，制作急性胃黏膜損傷大鼠動物模型。用免疫組化方法檢測HSP60及Smac表達。結(jié)果 與空白對照組相比，模型對照組大鼠Smac、HSP60表達均顯著升高差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；艾灸穴位組HSP60表達明顯上調(diào)（P＜0.01），而Smac表達明顯被抑制（P＜0.01）。與模型對照組相比，艾灸穴位組Smac表達明顯下降（P＜0.01），HSP60表達顯著提高差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論 艾灸足陽明經(jīng)穴預處理可以誘導保護性蛋白HSP60的過度表達，抑制促凋亡因子Smac表達，從而起到保護胃黏膜損傷的作用。

艾灸；胃黏膜損傷； HSP60；Smac

急性胃黏膜損傷（Acute Gastric Mucosal Lesion，AGML ）又名急性出血性糜爛性胃炎[1]，近年來的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尋求預防本病的有效方法已成為臨床亟待解決的問題之一。研究已表明，針灸對胃黏膜的保護不僅具有抗損傷作用，同時還能促進潰瘍表面修復和愈合。本實驗課題通過探討艾灸預處理對胃黏膜損傷后HSP60和Smac表達的影響，以期揭示艾灸足陽明經(jīng)穴預處理對急性胃黏膜損傷的內(nèi)源性保護機制，為臨床防治胃黏膜病變提供實驗依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康SD大鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g。由上海西普-比凱爾實驗動物有限公司提供。

1.1.2 主要實驗儀器 艾條（中國南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠，型號：mg-454，規(guī)格：18×200mm）；自制艾灸支架；石蠟切片機（美國）；顯微成像系統(tǒng)OLYMPUS Bx-70；Imagepro-Plus圖像分析軟件。

1.1.3 實驗試劑 HSP60、Smac免疫組化法試劑盒（北京·中杉）

1.2 方法

1.2.1 動物分組 24只大鼠隨機分為3組，每組8只。即：空白對照組（A組）、模型對照組（B組）、艾灸穴位組（C組）。

1.2.2 穴位定位 根據(jù)《實驗針灸學》大鼠穴位定位方法及擬人比照法，取足三里和中脘穴。

足三里：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5mm處。

中脘：以胸鎖聯(lián)合和恥骨聯(lián)合連線下1/4與上3/4交點為肚臍，再以胸劍聯(lián)合到肚臍連線中點。

1.2.3 艾灸方法 大鼠仰臥位束縛于鼠板上，定穴剪毛，將艾條固定于自制艾炷支架上，使艾條燃燒部位垂直距離穴位約3 cm，點燃施灸，艾灸30min/（d·穴），連續(xù)艾灸8 d。

1.2.4 造模方法 以95%無水乙醇灌胃（0.6mL/100 g） 10 h。

1.2.5 實驗步驟 空白對照組和模型對照組捆綁處理30min/天；艾灸穴位組艾灸中脘穴和一側(cè)足三里穴30min/d，左右交替。各組處理8 d后，大鼠禁食不禁水24 h，繼以無水乙醇灌胃10 h，摘取胃組織，檢測各項指標。

1.2.6 胃組織標本處理和檢測 用棉線結(jié)扎胃幽門部，將4%多聚甲醛5 mL，自食道注入胃內(nèi)后，結(jié)扎賁門，在兩結(jié)扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃，10min后沿胃大彎剖開，生理鹽水將胃內(nèi)容物沖洗干凈，定性濾紙吸干生理鹽水，然后在胃竇部取約0.5 cm×0.5 cm大小組織塊放入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋備用。分別按照HSP60和Smac試劑盒說明書檢測。

用PBS代替一抗作陰性對照。HSP60、Smac蛋白陽性判定標準為細胞漿或細胞核中出現(xiàn)棕黃色細顆粒狀。采用Imagepro-Plus圖像分析軟件，光鏡下10×40倍，每張切片隨機分析5個視野，計算HSP60和Smac數(shù)密度（陽性細胞數(shù)/統(tǒng)計場面積），取其平均值作為結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS14軟件進行分析，用“x±s”表示。所有資料進行正態(tài)性檢驗；符合正態(tài)分布者，多組計量資料采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者用LSD法，方差不齊者用Tamhane’s T2法；不符合正態(tài)分布者采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 艾灸對急性胃黏膜損傷大鼠HSP60表達的影響

與空白對照組相比，模型對照組HSP60表達明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明無水乙醇灌胃，引發(fā)胃黏膜應(yīng)激反應(yīng)，機體HSP60表達升高。與模型對照組相比，艾灸穴位組HSP60表達明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明艾灸預處理可誘導HSP60過度高表達。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠胃黏膜HSP60的表達（x±s，n=8）

2.2 艾灸對急性胃黏膜損傷大鼠Smac表達的影響

模型對照組大鼠Smac表達明顯高于空白對照組（P＜0.01），提示無水乙醇灌胃造成胃黏膜損傷，導致胃黏膜細胞Smac表達上調(diào)。與其他兩組相比，艾灸穴位組Smac表達顯著下調(diào)（P＜0.01），提示艾灸足陽明胃經(jīng)“足三里”等穴預處理可以下調(diào)Smac表達，結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜Smac的表達（x±s，n=8）

3 討論

胃黏膜損傷在中醫(yī)屬于“胃痛”、“嘔吐”范疇，主要是由寒邪客胃、飲食傷胃、肝氣犯胃、脾胃虛弱等病因引起?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，胃內(nèi)環(huán)境惡化、胃黏膜損傷是胃病的主要發(fā)病機制。飲食中的許多成分如乙醇等，均可能刺激損傷胃臟。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）[1]是一類高度保守的應(yīng)激蛋白，在許多應(yīng)激狀態(tài)下（如高溫、缺氧、病毒及細菌感染、重金屬感染等）表達可高達15%以上。急性胃黏膜損傷時，依照細胞適應(yīng)性保護原則，胃黏膜上皮細胞能積極調(diào)整保護機制，促進HSP合成。HSP60不僅可以作為一個分子伴侶，同時還可以參與細胞凋亡[2-3]。張紅艷等通過熱休克預處理誘導HSP60過量表達減輕了嚴重燒傷誘導的大鼠急性胃黏膜損傷[4]。課題組在以往關(guān)于家兔胃黏膜損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，艾灸足三里、梁門穴預處理可促進束縛水浸應(yīng)激所造成大鼠胃黏膜損傷的修復[5]、胃黏膜增值加強[6]。本實驗觀察到，無水乙醇造模后，模型對照組胃黏膜HSP60表達顯著高于空白對照組，提示在急性外來刺激下，大鼠胃黏膜HSP60應(yīng)激性表達增加。而艾灸中脘、足三里穴組胃黏膜中HSP60過度高表達，提示艾灸中脘、足三里穴可誘導急性胃黏膜損傷大鼠胃黏膜中HSP60的高表達，從而保護胃黏膜。

線粒體促凋亡蛋白（Smac）也稱為DIABLO （direct IAP binding protein with low PI），是2000年發(fā)現(xiàn)的一種由線粒體釋放的促凋亡蛋白，參與細胞凋亡線粒體通路下游反應(yīng)，促進細胞凋亡的發(fā)生[7]。已有研究資料表明，艾灸對應(yīng)激性胃潰瘍大鼠的影響，發(fā)現(xiàn)艾灸足三里、梁門穴后大鼠胃黏膜增殖細胞核抗原（ PCNA） 增加，細胞凋亡指數(shù)下降[8]。但關(guān)于艾灸與Smac表達的研究比較少。本次實驗數(shù)據(jù)表明，模型對照組Smac明顯高于空白對照組（P＜0.01），表明胃黏膜損傷可誘導Smac表達，而艾灸穴位組Smac表達明顯減少，說明艾灸可以抑制Smac表達。

本實驗從“艾灸中脘、足三里穴誘導HSP60表達→抑制Smac表達→保護胃黏膜損傷”的思路出發(fā)，比較了艾灸足陽明經(jīng)穴對急性胃黏膜損傷大鼠HSP60和Smac表達的影響，初步探討了艾灸預處理促進急性胃黏膜損傷修復的內(nèi)在機制，為艾灸預防急性胃黏膜損傷提供了實驗依據(jù)。

[1]李潤玖,李 銳,張 彧.熱休克蛋白生物學功能及其在腎損傷中作用的研究進展[J].中國急救復蘇與災(zāi)害醫(yī)學雜志,2008,3(2):121-125.

[2]陳演江,肖德生,汪鳳維,等.艾灸對大鼠胃潰瘍模型的影響[J].針刺研究,1992,17(2):113-116.

[3]孫茂峰,王茵萍.針灸保護胃黏膜臨床與實驗研究進展[J].中國針灸,2000,20(7):441-445.

[4]張紅艷,呂農(nóng)華,謝勇,等.HSP60和HSP70在嚴重燒傷大鼠胃黏膜的表達及對胃黏膜的保護作用[J].江西醫(yī)學院學報,2008,48(2):34-38.

[5]易受鄉(xiāng),彭 艷,常小榮,等.艾灸預處理對應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜增殖修復的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007;2(1):21-24.

[6]易受鄉(xiāng),彭 艷,常小榮,等.艾灸對應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃黏膜細胞增殖和凋亡的影響及其與熱休克蛋白表達關(guān)系的研究[J].針刺研究,2006,31(5):259-263.

[7]Verhagen AM,Ekert PG,Pakusch M,et al.Identification of DIABLO,a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins[J].Cell,2000,102:43-53.

[8]常小榮,彭娜,易受鄉(xiāng),等.艾灸足三里和梁門穴誘導熱休克蛋白70抗大鼠胃黏膜氧化損傷作用[J].世界華人消化雜志,2006,14(35):3405-3408.

Effects of moxibustion on acupoint Zusanli and the expressions of HSP60 and Smac in acute gastric mucosal lesion of rats

YU Jie, PENG Hong , LIN Ya-ping, YI Shou-xiang
(School of Acupuncture & Moxibustion and Massotherapy, Hunan College of Traditional Chinese Medicine, Hanpu Science & Education District, Changsha, Hunan 410208，China)

moxibustion; gastric mucosal lesion; heat shock protein 60; Smac

R245

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.08.006.014.03

〔Absrract〕Objective To observe the effects of moxibustion pre-treatment at Zusanli and Zhongwan acupoints on expressions of heat shock protein (HSP)60 and Smac in a rat model of acute gastric mucosal lesion (AGML) and explore the underlying protective mechanisms of moxibustion for gastric mucosal lesion. Methods A total of 24 Sprague Dawley rats were divided into 3 groups, i.e. blank, model and moxibustion acupoint (n=8 each). After an 8-day moxibustion pretreatment, the gastric lavage of anhydrous ethanol was used to establish the AGML model. The immunohistochemistry was used to examine the expressions of HSP60 and Smac. Results As compared with the blank group, the expressions of Smac and HSP60 were markedly elevated in the model groups (P＜0.01); The expressions of HSP60 was markedly elevated in the moxibustion acupoint group (P＜0.01) while those of Smac became obviously suppressed (P＜0.01). As compared with the model group, the expressions of Smac decreased significantly in the moxibustion acupoint group (P＜0.01) while those of HSP60 increased markedly (P＜0.01). Conclusion The pre-treatment of moxibustion could alleviate the gastric mucosal lesion caused by anhydrous ethanol, induce the over-expressions of HSP60 and down-regulate the expression of Smac so as to protect against gastric mucosal lesion.

2012－03－09

國家自然科學基金項目（81072867，307727707）、湖南省教育廳項目（10C1034）資助。

郁 潔（1979－）女，博士，講師，主要研究方向：針灸治病機理的研究。

林亞平（1956－），女，湖南長沙人，教授，碩士研究生導師，Email:lyplinda@yahoo.com.cn

（本文編輯 韓志濤）