雜交法檢測重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)發酵產物HBsAg外源基因拷貝數

張海春，李貴興，陳廣東，張 平，范艷云

(大連漢信生物制藥有限公司，遼寧大連 116600)

雜交法檢測重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)發酵產物HBsAg外源基因拷貝數

張海春，李貴興，陳廣東，張 平，范艷云

(大連漢信生物制藥有限公司，遼寧大連 116600)

以漢遜酵母宿主基因組DNA和發酵產物基因組DNA的相同MOX啟動子的片斷為特異性探針，用地高辛標記后，與固定在雜交膜上的宿主基因組DNA和發酵產物基因組DNA進行雜交并顯色，根據顯色深度來判定發酵產物中外源基因拷貝數的大小。結果表明，發酵產物中HBsAg外源基因拷貝數不小于30個。該方法檢測靈敏度較好，特異性較強，操作較安全，可用于重組漢遜酵母發酵產物中HBsAg外源基因拷貝數定性檢測。

宿主菌基因組DNA;發酵產物基因組DNA;外源基因拷貝數

隨著現代生物技術的發展，越來越多的重組產品投放市場。國內以漢遜酵母作為宿主菌進行表達的重組產品中外源基因拷貝數的檢測方法報道很少，為此有必要建立通過地高辛標記探針來檢測重組漢遜酵母外源基因拷貝數檢測方法，以檢測發酵產物的穩定性，確保HBsAg在發酵產物中表達的水平。

1 材料與方法

1.1 材料

漢遜酵母宿主菌ATCC34438購自美國菌種保藏中心［1］;重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)發酵產物由大連漢信生物制藥有限公司制備;DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收純化DNA試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;Hybond－N(帶正電荷)尼龍膜購自英國Amersham Pharmacia biotech公司;DNA標記和檢測試劑盒購自Roche。

1.2 儀器

TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice TP600，DZF－3型真空干燥箱(上海福馬實驗設備有限公司)，HH－4型數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 宿主菌/發酵產物基因組DNA的制備

宿主菌菌體和發酵產物菌體用酸洗玻璃珠破碎后，通過DNA提取試劑盒制備。

1.3.2 樣品純度及濃度檢測［2］

通過1%瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法測定DNA純度和濃度，于－20℃凍存備用。

1.3.3 探針DNA片段的制備

PCR法擴增:按順序在200 μL離心管中依次加入10X Taq DNA聚合酶緩沖液5 μL，dNTP液 4 μL，引物1(20 μmol·L－1)1 μL，引物2(20 μmol· L－1)1 μL，宿 主 菌 基 因 組 DNA 模 板1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，補加滅菌注射用水至50 μL，混勻。按下列步驟循環:95℃2 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，循環30次;72℃ 10 min。

瓊脂糖凝膠回收純化DNA試劑盒回收探針DNA片段。

1.3.4 探針DNA標記和標記率檢測

探針標記:取1 μg探針DNA加滅菌注射用水至15 μL，沸水中煮沸10 min，在冰浴中迅速冷卻 5 min，再加入2 μLhexanucleotide mixture 、2 μL dNTP labeling mixture 、1 μL Klenow enzyme ，混合后短暫離心，于37℃恒溫水浴鍋中反應20 h。取出后置65℃水浴中孵育10 min終止反應。加入3 mol·L－1乙酸鈉溶液 2 μL，－20 ℃預冷的無水乙醇 80 μL，于 －20 ℃ 作用 2 h，12 000 r·min－1離心15 min，棄上清，加入－20℃預冷的75%乙醇溶液100 μL洗滌沉淀一次，棄上清，室溫吹干后加入10 μL TE緩沖液溶解沉淀，即為標記的探針DNA。

1.3.5 探針標記率檢測［3］

取DIG－Labeled Control DNA稀釋成1 ng·μL－1，分別依次稀釋至 10，3，1，0.3，0.1，0.03，0.01 pg·μL－1。同時取標記好的探針，按照上述方法依次稀釋，然后分別取各濃度點樣1 μL于尼龍膜上，經固定和封閉后，通過AP緩沖液和NBT/BCIP進行顯色反應，比較兩者顯色深淺從而確定標記探針的濃度。

1.3.6 外源基因拷貝數檢測

將準備好的發酵產物基因組DNA樣品與宿主菌基因組DNA樣品、DNA稀釋液置100℃水浴中加熱10 min，迅速冰浴冷卻，以8 000 r·min－1離心5 s，然后點膜，120℃干烤30 min固定，雜交過夜，之后用AP緩沖液和NBT/BCIP進行顯色反應，與宿主菌基因組DNA單拷貝數進行比較，根據顏色深淺判定發酵產物中HBsAg外源基因拷貝數的大小。

1.3.7 雜交及顯影

雜交及顯色過程均按照羅氏地高辛試劑盒的操作手冊進行，略有改動。

1.3.8 重現性

按照上述檢測方法，對2批發酵產物進行2次測定，比較2次結果，考察該檢測方法的重現性。

2 結果與討論

2.1 宿主菌和發酵產物基因組DNA［4］

部分從菌體中提取出的宿主菌基因組DNA和發酵產物基因組DNA電泳圖，如圖1和圖2。結果表明，制備的基因組 DNA無RNA存在。A260/A280比值為 1.80 和 1.82，純度符合要求。

圖1 宿主菌基因組DNA電泳圖

圖2 發酵產物基因組DNA電泳圖

2.2 探針標記效率的檢測

探針標記效率的檢測結果如圖3。標記探針0.1pg稀釋點可見顯色，表明標記探針達到預期的標記效率，而且效率較高。經比較兩者顯色深淺，表明標記達到了要求的量，確定探針濃度為100 ng·μL－1。

圖3 探針標記效率檢測圖(陽性對照)

2.3 發酵產物中外源基因拷貝數的檢測

對2批發酵產物進行了HBsAg外源基因拷貝數檢測，如圖4。

圖4 重組漢遜酵母發酵產物外源基因拷貝數檢測圖

由圖4可看出，發酵產物DNA的30倍稀釋顯色深度不小于宿主菌基因組DNA的顯色深度，說明發酵產物HBsAg外源基因拷貝數不小于30個。

2.4 討論

通過采用地高辛標記探針的雜交法，對重組漢遜酵母發酵產物中外源基因拷貝數進行定性檢測，結果證明該方法具有較好的靈敏度和特異性，可以用于重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)生產過程中的質量控制，從而保證其穩定性，也可以為其他重組漢遜酵母生物制品中外源基因拷貝數的檢測提供參考。提取DNA的菌體材料最好是新鮮培養的菌體，這樣易于DNA的提取，同時提取的DNA不應被RNA或蛋白污染，否則將會影響到紫外定量的準確性。使用DNA回收試劑盒進行探針用DNA的回收，最好做進一步的純化，否則回收產物中會攜帶一定量的凝膠小顆粒，這些小顆粒會吸附探針并且會結合到膜上，影響雜交結果的觀察。

3 結語

本實驗成功建立了外源基因拷貝數的檢測方法。此實驗所涉及的操作方法難度小，檢測成本相對較低，但操作周期較長，中間環節繁瑣，結果受干擾的因素較多。相信隨著生物技術的發展，此方法會得到進一步的改進，同時應加快新方法的探索。

［1］蘇彩霞，張萍，顧美榮，等.重組HBsAg在漢遜酵母中的分泌表達［J］.中國生物制品學雜志，2009，22(2):158－161.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010.

［3］周長發，張銳，張曉，等.地高辛隨機引物法標記探針的southern雜交技術優化［J］.中國農業科技導報，2009，11(4):123 －128.

［4］劉君，張振龍.地高辛標記探針檢測重組人干擾素β1b中DNA殘留量［J］.微生物學免疫學進展，2007，35(2):19－21.

Hybridization Detection of Copy Number of HBsAg Foreign Gene in Fermentation Products of Recombinant Hepatitis B(Hansenula)

ZHANG Hai－chun，LI Gui－xing，CHEN Guang－dong，ZHANG Ping，FAN Yan－yun
(Department of R＆D，Dalian Hissen Bio－Pharmaceutical INC，Dalian Liaoning 116600，China)

The same MOX promoter fragments of Hansenula yeast host genomic DNA and fermentation products genomic DNA are taken as specific probes.Then the specific probes with digoxigenin labeled are hybridized and been color with host genome DNA fixed in the hybrid membrane and fermentation products genome DNA.The copy number size of foreign gene in fermentation product according to the color depth can be determined.The results show that the copy number of HBsAg foreign gene in fermentation product is not less than 30.The method has such advantages as better detecting sensitivity，stronger specificity and good safety.Therefore，it can be used in qualitative detection of copy number size of HBsAg foreign gene in fermentation product of recombinant Hansenula yeast.

host genomic DNA;fermentation products genomic DNA;foreign gene copy number

O621.14

A

1009－315X(2012)01－00012－03

2011－07－17;最后

2011－09－13

張海春(1978－)，女，滿族，河北秦皇島人，主要從事重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)工藝質量控制研究。

(責任編輯 鄒永紅)