Ki67在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)及意義

摘 要 目的：探討Ki67在人胃癌細(xì)胞SGC7901、BGC-823中的表達(dá)及意義。方法：選擇兩種不同的胃癌細(xì)胞（人胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)胞SGC7901，人胃低分化腺癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞），采用細(xì)胞免疫化學(xué)SABC法和及western-blot法對兩種胃癌細(xì)胞中Ki67表達(dá)情況進(jìn)行檢測和分析。結(jié)果：Ki67在兩種胃癌細(xì)胞中都高表達(dá)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：Ki67參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。且Ki67蛋白高表達(dá)可能是胃癌細(xì)胞的重要生物學(xué)標(biāo)志。

關(guān)鍵詞 胃癌 免疫細(xì)胞化學(xué) Western blot Ki67doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2012.30.213

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤，且死亡率極高，嚴(yán)重威脅人類的生命[1]。Ki67是一與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，與腫瘤增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[2]。本研究應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)SABC和Western blot對胃癌細(xì)胞株SGC7901、BGC-823進(jìn)行檢測，探討Ki67在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及在胃癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

資料與方法

材料：①細(xì)胞：人胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)胞SGC7901購自武漢生命科學(xué)細(xì)胞中心，人胃低分化腺癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞購自武漢博士德生物工程有限公司。②試劑：RPMI-1640購自Gibeo公司；Ki67單克隆抗體購自北京中杉金橋有限生物公司；DAB顯色試劑盒及即用型（鼠/兔）SABC免疫組化染色試劑盒購自北京中衫生物技術(shù)有限公司。PIRA裂解液購自北京中衫生物技術(shù)有限公司。

方法：①細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞株SGC7901、BGC-823在RPMI-1640完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。完全培養(yǎng)液中含有10%的小牛血清（CS）、1%青霉素、1%鏈霉素。培養(yǎng)條件為濕潤狀態(tài)下37℃和5% CO2。②免疫細(xì)胞化學(xué)：常規(guī)消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度2×105/ml。將高壓滅菌的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，滴加細(xì)胞懸液2.5ml/孔，待細(xì)胞爬滿蓋玻片時，取出細(xì)胞爬片，浸入固定液4%多聚甲醛30分鐘，PBS（pH 7.2～7.6）浸洗3×3分鐘后進(jìn)行染色。采用SABC免疫組化法，具體步驟按照試劑盒說明操作。試劑盒里的陽性片為陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。③結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：CyclinD1、Ki67陽性細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)含棕黃色顆粒。在光鏡下，結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率兩個參數(shù)，綜合判定CyclinD1、Ki67的陽性染色。用BioMias圖像處理系統(tǒng)在100倍鏡下選取癌視野中5個區(qū)域，分別在高倍鏡（400×）下隨機(jī)選擇25個視野。采用Image Pro Plus 5.0圖像分析軟件檢測陽性染色的積分光密度值（IOD）。④Western blot方法：收集細(xì)胞，裂解得總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白。調(diào)整樣品蛋白濃度使其相同，取樣品經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉2小時，加入一抗過夜。經(jīng)洗滌后，加入二抗，室溫孵育2小時。最后用ECL顯影并掃描測灰度值。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以（x±S）表示，根據(jù)數(shù)據(jù)來源和統(tǒng)計學(xué)要求進(jìn)行重復(fù)測量的方差分析。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Ki67在兩種胃種胃癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)：Ki67在胃癌細(xì)胞株中陽性表達(dá)均呈棕黃色，并且定位于細(xì)胞核。人胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)胞SGC7901中Ki67的蛋白表達(dá)IOD值（5018.210±107.628）△明顯高于BGC-823細(xì)胞（1966.439±123.020），差異有顯著性（P<0.05）。

Western blot檢測Ki67在各宮頸癌細(xì)胞株中的蛋白含量：人胃癌細(xì)胞株SGC7901、BGC-823內(nèi)均有Ki67陽性蛋白表達(dá)條帶。蛋白條帶灰度值分析表明：人胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)胞SGC7901中Ki67蛋白的陽性表達(dá)均高于人胃低分化腺癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞，差異有顯著性（P<0.05）。

討 論

細(xì)胞的增殖狀態(tài)，對研究腫瘤生物學(xué)行為、判斷其危害性具有及其重要意義。一旦細(xì)胞周期調(diào)控失常，就會導(dǎo)致腫瘤的惡性增生[3]。Ki67是應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一。Ki67蛋白是由兩條多肽鏈組成，Ki67抗原的量隨細(xì)胞周期的不同而發(fā)生改變。在G1中期到后期出現(xiàn)表達(dá)，S期和G2期逐漸增加，有絲分裂期達(dá)到高峰，分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇?，F(xiàn)認(rèn)為Ki67的功能與染色質(zhì)相連，與細(xì)胞的有絲分裂有關(guān)[4]。Ki67的表達(dá)和細(xì)胞增殖狀態(tài)密切相關(guān)，是反映細(xì)胞增殖的主要生物學(xué)指標(biāo)。因此，通過本研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株SGC7901中Ki67的表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移細(xì)胞株BGC-823（P<0.05），提示Ki67的高表達(dá)與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

腫瘤細(xì)胞的異常增殖可以通過多種方式與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。由此可見，Ki67在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的作用。它不僅能客觀反映胃癌細(xì)胞的增殖活性，并能評估癌細(xì)胞發(fā)生增殖、轉(zhuǎn)移的潛能[5]。因此認(rèn)為，Ki67高表達(dá)可能導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖周期調(diào)控失常，使細(xì)胞發(fā)生無限制增殖及異常分裂，最終導(dǎo)致胃癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)

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