副溶血性弧菌熒光快速檢驗方法的研究

摘 要:為了快速識別副溶血型弧菌導致的食物中毒和食品污染，本文經(jīng)過試驗研究采用免疫熒光原理使用熒光二抗血清在熒光顯微鏡下識別副溶血型弧菌熒光菌球，以期達到快速篩查副溶血弧菌污染食品目的。本方法適用于海洋水產(chǎn)品和淡水水產(chǎn)品及加工的含鹽其它食品。

關鍵詞:副溶血性弧菌 熒光 快速檢驗

中圖分類號:TH715文獻標識碼:A文章編號:1674-098X(2012)04(b)-0232-01

副溶血性弧菌 ( Vibrioparahaemolyticus Vp)是一種具有嗜鹽性的細菌，常存在于近海海水、海底沉積物、海產(chǎn)品及鹽漬食品中，是夏、秋季沿海地區(qū)食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌。根據(jù)國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)對我國部分地區(qū)食源性疾病爆發(fā)情況的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，中國近年由VP引起的食物中毒呈顯著上升趨勢，Vp感染已成為中國一個嚴重的食源性公共衛(wèi)生問題之一。

副溶血性弧菌常規(guī)檢驗方法主要通過樣品富集培養(yǎng)、分離、生化鑒定、血清學分型、藥敏試驗報告結果。存在檢驗周期長和標本腐敗變質快不利于對突發(fā)食物中毒事件的處置及復現(xiàn)標本試驗的問題。

副溶血性弧菌免疫熒光快速檢驗方法是通過磁珠富集固定和快速選擇性增菌，使用熒光檢測方法，應用免疫學實驗技術，通過對副溶血性弧菌的熒光二抗制片和固定，在落射型熒光顯微鏡下觀察標本片來識別副溶血性弧菌。該方法具有檢驗時間短檢出概率高的特點，可以應用到食品快速檢驗領域。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

熒光抗體染色是熒光顯微鏡標本上的抗原—抗體反應和熒光結合第二抗體反應。必須制成鏡檢標本。作為檢測抗原目的標本片，細菌檢樣作成單層。夾心法，即用未標記的特異性抗原加在玻片上先與菌體中之相應抗體結合，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上，而在熒光激發(fā)下間接地顯示出菌體中抗體的存在。實驗中應注意所用熒光二抗采用進口兔抗羊血清，相較國產(chǎn)熒光抗血清具有更好的熒光強度。所用試劑在用前需要進行熒光物質檢查防治導致誤判。

1.2 主要儀器設備及試劑

(1)拍打式均質器。

(2)電動試管振蕩器。

(3)低溫高速冷凍離心機(25000r/min)。

(4)天平(0.1g)。

(5)直落式熒光顯微鏡。

(6)水套式培養(yǎng)箱。

(7)高壓滅菌器。

(8)副溶血型弧菌羊抗血清。

(9)兔抗羊熒光抗血清。

(10)甲醇。

(11)無熒光丙三醇(甘油)。

(12)PBS緩沖液。

(13)無菌高純蒸餾水(無熒光)。

(14)次氯酸鈉消毒液。

(15)封片甘油:無熒光甘油9份，pH7.2 PBS 1份。

1.3 樣品制備

(1)冷凍樣品應在45℃以下不超過15min或在2～5℃不超過18h解凍。若不能及時檢驗，應放于-15℃左右保存;非冷凍而易腐的樣品應盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應置于6～10℃冰箱保存，在24h內(nèi)檢驗。

(2)取樣:以無菌操作進行。

(3)魚類:取魚體不同部位。貝類:取內(nèi)臟或含內(nèi)臟的全部貝肉;如為帶殼貝類，則應先在清潔的流水中洗刷凈外殼，然后以無菌操作打開貝殼，取出內(nèi)臟或含內(nèi)臟的全部貝肉和貝液。甲殼類:取包括鰓及腸的部分或整體。

(4)將樣品稱取25g，于100ml0.45%生理鹽水—TWEEN80中均質拍打20分鐘，1500r/min，10min，離心，吸取上清液到第二個離心管中。加入5ml有機試劑，2000r/min，10min。吸取上清水相液到第三個離心管，6000r/min，20分鐘。傾去溶液，將沉淀用5ml無菌水洗滌懸浮后離心3次備用。

1.4 實驗方法

(1)本自發(fā)熒光對照:已知抗原標本加1～2滴PBS或不加，應無熒光出現(xiàn)。

(2)抗原對照:已知抗原加正常同種動物標記球蛋白溶液染色，應無熒光。

(3)阻抑試驗:標本滴加同種未標記抗體感作30min后，再加標記抗體，鏡檢應無熒光現(xiàn)象。

(4)種屬抗原染色:標記抗體與種屬抗原標本染色，應無熒光出現(xiàn)。

(5)陽性對照:標記抗體與已知抗原染色，應呈強熒光反應。對照染色可根據(jù)條件適當選擇。

(6)標本經(jīng)固定后，于被檢標本上滴加已知未標記的抗體(或抗原)置濕盒37℃反應30min。

(7)先以pH7.2 PBS沖洗，然后浸泡于三缸PBS中，每缸3min并注意振蕩。

(8)棄掉PBS，用吸水紙吸干。

(9)滴加熒光羊抗兔抗血清，置濕盒37℃感作30min。

(10)以PBS浸洗3次，最后用蒸餾水洗1次，滴加緩沖甘油封片鏡檢。

(11)熒光點全視野計數(shù)即為檢出樣本中副溶血性弧菌菌量。

(12)O抗原需要高壓破壞H抗原后測定，將菌懸液121℃高壓20min后用于檢測。此檢驗出陽性圖片上菌落為死亡菌，如采用K抗原進行實驗則圖片菌落為活性菌，需要注意生物安全！

(13)所有檢驗完成后的圖片應該及時投入到盛有次氯酸鈉消毒劑的標本缸中浸泡消毒，定期對標本缸中污染載玻片高壓消毒。

(14)除測定O抗原高壓處理以外的菌體離心物均可以直接用于增菌和免疫磁珠富集分離實驗，其獲得的培養(yǎng)物鑒定按副溶血性弧菌檢驗標準執(zhí)行。

2 實驗結果

采用本所收集的10株副溶血性弧菌，采用人工污染方式分別污染蝦肉、魚肉、貝肉和鹵豬肉食品各10份，污染含菌量的調節(jié)采用連續(xù)稀釋法，稀釋計數(shù)采用血球計數(shù)板鏡檢計數(shù)，TCBS平板計數(shù)校正。

樣品分別在污染菌數(shù)為1000-1500CFU/g、100-200CFU/g、5-25CFU/g，采用國標方方和本研究方法對照檢測，表1。

3 結語

采用標準方法檢測當含菌量低于20CFU/g時檢出率急劇降低，但是采用熒光法依然可以保持比較高的檢出率。方法最后校正檢出率可以達到10CFU/g。存在的問題，樣品加熱后用熒光免疫法依然可以檢出，但是菌體為死亡菌體，這個可以有利于發(fā)現(xiàn)曾被污染過的食品，但是培養(yǎng)法卻做不到這點。這也是可以反映為何熒光檢出后培養(yǎng)陰性問題。對于熒光法陽性檢出為了穩(wěn)妥可靠依然建議采用國標法培養(yǎng)和生化鑒定。

該方法的優(yōu)勢可以在最短時間方便檢出疑似樣品是否含有副溶血性弧菌，具有快速簡便低成本的特點，實驗室要求設置不需要特別建設符合生物安全規(guī)范要求即可。該法也可以滿足現(xiàn)場檢測要求，符合快速檢測需求的要求。