胎兔動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

摘要目的：建立胎兔動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。方法：采用組織塊改良貼壁法（玻片壓迫組織塊貼壁方法）進(jìn)行胎兔動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)，并行免疫組織化學(xué)法對培養(yǎng)細(xì)胞的進(jìn)行鑒定。結(jié)果：經(jīng)10～14天培養(yǎng)后，培養(yǎng)皿底及蓋玻片上鋪滿梭狀細(xì)胞，免疫組織化學(xué)法鑒定確認(rèn)為胎兔動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞。結(jié)論：植塊改良貼壁法可以成功的進(jìn)行胎兔動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)，且本法簡便，可靠，短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量細(xì)胞，從而為動脈導(dǎo)管未閉發(fā)病機(jī)制的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞平滑肌細(xì)胞動脈導(dǎo)管細(xì)胞培養(yǎng)胎兔

動脈導(dǎo)管未閉（PDA）是小兒先天性心臟病常見的類型之一，占先天性心臟病發(fā)病總數(shù)的15%。胎兒時(shí)期，動脈導(dǎo)管的被動開放是血液循環(huán)的重要通道，它分流了超過一半的右心室輸出量繞過未膨脹的肺進(jìn)入臍循環(huán)進(jìn)行氣體交換。出生后，隨著首次呼吸的建立，動脈氧分壓的增高，肺循環(huán)阻力的降低，動脈導(dǎo)管逐漸關(guān)閉。而早產(chǎn)兒由于動脈導(dǎo)管平滑肌發(fā)育不良，平滑肌對氧分壓的反應(yīng)性低于足月兒，因此早產(chǎn)兒動脈導(dǎo)管未閉的發(fā)生率較高，約占早產(chǎn)兒的20%，且伴呼吸窘迫綜合征的早產(chǎn)兒發(fā)病率更高。因此，對于動脈導(dǎo)管未閉發(fā)生機(jī)制的研究及適當(dāng)?shù)母深A(yù)和治療在預(yù)防和降低早產(chǎn)兒的死亡率上具有重要的意義。

動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞（DASMCs）是構(gòu)成動脈導(dǎo)管中層的主要細(xì)胞成分，其增殖、遷移及凋亡均與生后動脈導(dǎo)管的關(guān)閉密切相關(guān)。因此，體外培養(yǎng)動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞是研究動脈導(dǎo)管未閉發(fā)病機(jī)制的重要手段。由于影響血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的因素很多，尤其是動脈導(dǎo)管因其組織量較少，培養(yǎng)難度更大，因此國內(nèi)少見有動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型。本課題組，參照國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)，采用組織貼塊法成功培養(yǎng)出胎兔動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞，為動脈導(dǎo)管未閉發(fā)生機(jī)制的體外研究，提供了足量的細(xì)胞材料^[1，2]。

資料與方法

實(shí)驗(yàn)取材：選取孕29天的日本大耳白胎兔為研究對象，購于鄖陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。妊娠時(shí)間的計(jì)算是以在雌兔活動期與雄兔以1：1在晚間7：00～8：00合籠，第2天分開，于配種后5天進(jìn)行摸胎法，若觸及胎兔，以合籠當(dāng)晚為妊娠的起始點(diǎn)，若未觸及胎兔，隔1周再次合籠。

實(shí)驗(yàn)主要試劑：DMEM干粉；胎牛血清（FBS）；鼠抗兔α-平滑肌肌動蛋白（α-actin）；SP免疫組化試劑盒；青霉素鈉、硫酸鏈霉素。

原代培養(yǎng)：孕29天的日本大耳白胎兔在無菌環(huán)境下通過解剖顯微鏡取出動脈導(dǎo)管段，將其置于4℃的無菌PBS緩沖液中，洗滌凝血，然后在顯微解剖鏡下剝除動脈導(dǎo)管的外膜，用兩個(gè)小鑷子縱行撕開管腔，內(nèi)膜面向上，用銳利的刀片刮去內(nèi)膜，PBS緩沖液漂洗后，將其剪成1mm3大小左右，用鑷子將組織塊轉(zhuǎn)入直60mm的培養(yǎng)皿中，組織塊之間的間隔不大于2mm，然后用48mm×48mm的消毒蓋玻片小心蓋在組織塊上并輕壓組織塊，將含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，由NaHCO3和HEPES調(diào)PH值72滴加在蓋玻片上，使培養(yǎng)基慢慢滑滲入組織塊中，靜置8小時(shí)后，再加培養(yǎng)基，液體量以剛沒過蓋玻片且蓋玻片不漂移為宜，靜置2天后觀察。每兩天換1次培養(yǎng)基，同時(shí)觀察細(xì)胞的生長狀況及形態(tài)，直至細(xì)胞在組織塊周圍生長融合。