miRNA在癌癥的診斷與治療中的研究進展



miRNA的生物學特征

miRNA的概述：小分子RNA（miRNAs）是一種非編碼RNA長度約22個核苷酸（nt），其作用為于轉錄后調節基因表達。1993年首次在秀麗隱桿線蟲發育過程中描述了這種類型的調節^1，2，從此以后在其他的生物體內也對此類的調節加以描述。迄今為止，已在人體內發現超過1400的miRNA，這些基因大約占在人類基因組中的1%～3%³。據估計，30%～60%的蛋白質編碼基因由miRNA來調節^4，5。miRNA調節多個細胞增殖、凋亡相關基因的表達，從而多種病理生理學過程。然而，其主要功能還是建立和維護多種細胞類型的分化狀態⁶。miRNA存在于基因組的不同區域；其中70%位于基因內，宿主基因和miRNA具有相同的方向，且由相同啟動子區域調控，可與宿主同時表達⁷。40%的miRNA以基因簇的形式存在，每個基因簇中的miRNA調控一種共同的途徑⁸。

miRNA的生成：miRNA的生成是一個復雜的過程，他們首先通過的初級轉錄的miRNA（初級miRNA的）生成，它們可由60～80n長度莖環構成一個或幾個二級結構，這些莖環結構在細胞核中被識別并被Drosha酶，RNA酶Ⅲ核糖核酸內切酶，以及其伴侶DGCR-8切割⁹。Pri-miRNA裂解生成miRNA前體（premiRNAs），它們是長度約70個核苷酸的發夾結構且有2～3個核苷酸的突出¹⁰。前體miRNA可被輸出蛋白5以及其輔助因子RAN-GTP共同輸送至細胞質¹¹。最終，miRNA前體被Dicer酶，另一種核糖核酸內切酶核糖核酸酶Ⅲ及其伴侶-反式激活RNA結合蛋白（TRBP）加工成含有21～25nt的雙鏈miRNA¹²。一旦成為成熟的miRNA，其雙鏈就被Dicer酶加載至RNA誘導沉默復合物（RISC）內，保留其不太穩定的5'末端鏈，并隨即啟動轉錄后基因沉默。然而，剩余未使用的miRNA鏈可被納入細胞中特異外來內，并從細胞中排出¹³，其作用尚不完全清楚。這可導致細胞外的miRNA于體液主要是血清中出現。因此，使用血清miRNA對癌癥的診斷以及預后的可能性已引起廣泛關注。

miRNA的作用：哺乳動物體內miRNA通常是通過與目標mRNA的3'UTR部分互補結合從而抑制其翻譯表達¹⁴。不同物種中目標基因的表達與調控與miRNA的差異表達密不可分，因此這也使得對其調控機制的研究變得十分困難。然而，研究者已經開始探索新的miRNA和其下游靶基因，以及不同的物種細胞和組織中miRNA的表達譜¹⁵。近年來，越來越多的研究證實miRNAs腫瘤發生發展的各個階段，并與腫瘤的侵襲轉移密切相關，為腫瘤的診斷與治療提供了新的線索和思路。

miRNA與腫瘤的發生

miR-15a和miR-16-1是最早發現的與腫瘤相關的miRNA，位于人類染色體13q14區域的LEU2基因5、6外顯子之間，在慢性淋巴細胞白血病（CLL）中該區域的缺失被認為是導致了腫瘤侵襲轉移發生的因素之一¹⁶。正常細胞中miRNA可通過抑制抗凋亡原癌基因BCL-2的表達而誘導細胞凋亡¹⁷。同時也發現其他許多miRNA在癌癥發生中的改變，而大多數的改變導致了他們的調控異常。同時，研究還發現癌癥細胞中也存在著這些基因的表達異常，并且大多數受到不同miRNA的調控。

研究發現50% miRNA基因位于腫瘤相關的染色體或其脆性位點上，腫瘤的發生直接及間接與這些基因相關。已證實60%腫瘤的發生與抑癌基因p53的異常表達及突變有關，He等人發現miRNA可通過干預P53的表達過程來抑制腫瘤細胞的生長。Guil等人發現，RNA鏈接蛋白能促進特定miRNA的表達，從而影響腫瘤的發生發展，如連接蛋白hnRNPA1能與miR-18a特異結合，促進miR-18a大量表達，從而促進腫瘤的發生發展。現在很多證據證明miRNA的表達改變是腫瘤發生的共同特征。

miRNA與腫瘤的侵襲與轉移

腫瘤轉移是指腫瘤細胞從最初部位通過血液循環定植于遠隔器官并且不斷生長，侵襲轉移是惡性腫瘤的標志之一，也是導致癌癥患者的主要死亡原因。研究證實，miRNA參與腫瘤轉移的全過程，并可能成為治療惡性腫瘤的新靶點以及判斷病情預后的新標志。Kong等人發現¹⁸，miR-155表達水平升高可以促進腫瘤細胞間緊密連接的破壞，導致腫瘤轉移。敲除miR-155基因的乳腺癌細胞侵襲能力大大降低。上皮間質轉分化（EMT）是上皮細胞在某種特定的環境中獲得間質細胞特性，成為間質樣細胞其運動能力大大提高，此過程被認為是腫瘤細胞發生轉移的重要機制，miRNA 可通過促進腫瘤細胞EMT的發生從而增加細胞的侵襲轉移能力。E-鈣黏素（E-cadherin）與細胞黏附能力密切相關，是調節EMT發生的重要分子，鋅指蛋白轉錄因子ZEB1 和ZEB2可抑制E-cadherin的表達，從而促進腫瘤細胞EMT的發生，增加細胞的運動轉移能力。研究發現，miRNA分子也參與了該過程，抑制miR-200及miR-205，可促進ZEB1 及ZEB2 的表達上調¹⁹。Gebeshuber等人發現²⁰，miR-29a表達上調可抑制鋅指蛋白36-TTP蛋白（tristetraprolin），促進EMT過程發生，導致腫瘤轉移。miR-10b和miR-9是乳腺癌細胞侵襲和轉移的重要參與者。同源異型盒基因HOXD10是miR-10b的下游目標基因；過表達的miR-10b可導致HOXD10表達持續下調，而過表達的miR-10b可誘導RhoGTP酶的亞家族成員Rhoc表達上調，在體外實驗中過表達的HOXD10或者下調的Rhoc幾乎完全抑制miR-10b誘導的轉移和侵襲²¹。同時研究表明miR-9可直接作用于編碼E-cadherin的CDH1基因的mRNA進而增加細胞的侵襲轉移能力²²。

miRNA與腫瘤的診斷

miRNA的表達譜與腫瘤的胚胎起源密切相關，并且其表達多呈現組織特異性，因此，miRNA可以作為有效的腫瘤診斷標志物用于臨床。近年越來越多的證據表明循環中的miRNA 可作為無創的、敏感的腫瘤診斷標志物。Lu等最近提出利用全基因miRNA表達譜可鑒別一些靠組織學方法和基于mRNA的診斷法難以鑒別的低分化腫瘤²³。miRNA表達譜也可用于辨別同一器官但組織來源不同的腫瘤，如鑒別胰腺內分泌性腫瘤和腺泡腫瘤、肺鱗癌和腺癌等，另外也可辨別組織學結構相似但分子組成不同的血液系統腫瘤。Mitchell等發現miRNA尚存在于外周循環中²⁴，其種類和數量隨生理狀況、疾病的種類和病程不同而有所差異。

miRNA與腫瘤的治療

功能研究表明miRNA通過轉錄后調節機制影響基因的表達從而發揮致癌或者抑癌作用，因此miRNA以及其靶基因可作為治療腫瘤的有效的藥物作用靶點。目前最有潛力的治療手段是miRNA類似物（miRNA mimic）以及反miRNA寡聚核苷酸類。目前對miRNA進行干預來治療腫瘤主要有兩條思路：①通過轉染或直接導入人工合成的miRNA，使有抑癌基因特性的miRNA表達上調，從而抑制腫瘤的生長及轉移；②功能研究表明miRNA通過轉錄后調節機制影響基因的表達從而發揮致癌或者抑癌作用，因此miRNA以及其靶基因可作為治療腫瘤的有效的藥物作用靶點。目前最有潛力的治療手段是miRNA類似物（miRNA mimic）以及反miRNA用與特異miRNA互補的反義小分子核苷酸，與相應的miRNA相結合，來沉默或競爭性抑制其與目標mRNA的結合，使有癌基因特性的miRNA功能得以阻斷，達到抑制腫瘤生長的目的。在小鼠不同器官注入AMOs（一種抗microRNA寡核苷酸），抑制癌基因特性的microRNA，可以明顯抑制腫瘤的生長²⁵。用病毒或脂質法瞬時導入大量抑癌基因作用的microRNA，可用于某些腫瘤的治療^26，27。

2008年，首次進行了以調控miRNA為基礎臨床治療試驗。Ⅰ期臨床試驗使用與miR-122互補的LNA寡核苷酸來抑制此種致癌miRNA的表達，病毒的復制，通過抑制miR-122可治療丙型肝炎。2010年，宣布這項臨床試驗的成功，并開始第二階段臨床試驗²⁸。盡管這是目前唯一的應用于臨床miRNA表達調控的研究。然而另外幾項針對哮喘，白血病和其他類型腫瘤的miRNA調控的臨床試驗正在進行中。

問題與展望

miRNA是小分子，在調節基因表達，維持分化狀態和控制細胞周期等多種生理病理過程中均具有重要作用。據估計，大多數人通過表觀遺傳調控，而表觀基因的結構域中常常存在與miRNA靶向互補的區域，表明這些基因的調控是相互關聯的，這些基因及其調控途徑同時參與腫瘤的發生發展。miRNA的表達異常引起腫瘤發生，以及腫瘤細胞，耐藥，抗輻射，侵襲轉移等能力的變化。研究發現miRNA與不同類型癌癥的發生，癌癥的化療與放療相關，而腫瘤的侵襲與轉移可以導致更具個性化及更有效的癌癥治療藥物的研發。此外，miRNA表達譜及組織特異性可幫助尋找轉移腫瘤的原發灶成為腫瘤診斷治療良好的工具

總之，更好的了解miRNA的功能和作用機制可為腫瘤的診斷和治療提供更可靠的依據。

參考文獻

1Lee RC，Feinbaum RL and Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell，1993，75：843-854.

2Wightman B，Ha I and Ruvkun G.Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C.elegans.Cell，1993，75：855-862.

3Zhao Y and Srivastava D.A developmental view of microRNA function.Trends Biochem Sci，2007，32：189-197.

4Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function.Cell，2004，116：281-297.

5Friedman RC，Farh KK，Burge CB and Bartel DP.Most mammalian mRNAs are conserved targetsof microRNAs.Genome Res，2009，19：92-105.

6Bushati N and Cohen SM.microRNA functions.Annu Rev Cell Dev Biol，2007，23：175-205.

7Rodriguez A，Griffiths-Jones S，Ashurst JL and Bradley A.Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units.Genome Res，2004，14：1902-1910.

8Yuan X，Liu C，Yang P，He S，Liao Q，Kang S and Zhao Y.Clustered microRNAs' coordination inregulating protein-protein interaction network.BMC Syst Biol，2009，3：65.

9Landthaler M，Yalcin A and Tuschl T.The human DiGeorge syndrome critical region gene 8 and Its D. melanogaster homolog are required for miRNA biogenesis.Curr Biol，2004，14：2162-2167.

10Basyuk E，Suavet F，Doglio A，Bordonne R and Bertrand E.Human let-7 stem-loop precursorsharbor features of RNase Ⅲ cleavage products.Nucleic Acids Res，2003，31：6593-6597.

11Yi R，Qin Y，Macara IG and Cullen BR.Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs.Genes Dev，2003，17：3011-3016.

12Zhang H，Kolb FA，Brondani V，Billy E and Filipowicz W.Human Dicer preferentially cleavesdsRNAs at their termini without a requirement for ATP.EMBO J，2002，21：5875-5885.

13Etheridge A，Lee I，Hood L，Galas D and Wang K.Extracellular microRNA：a new source ofbiomarkers.Mutat Res，2011，717：85-90.

14Doench JG，Petersen CP and Sharp PA.siRNAs can function as miRNAs.Genes Dev，2003，17：438-442.

15Baskerville S and Bartel DP.Microarray profiling of microRNAs reveals frequent coexpression with neighboring miRNAs and host genes.RNA，2005，11：241-247.

16Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，Bichi R，Zupo S，Noch E，Aldler H，Rattan S，Keating M，Rai K，Rassenti L，Kipps T，Negrini M，Bullrich F and Croce CM.Frequent deletions and downregulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99：15524-15529.

17Cimmino A，Calin GA，Fabbri M，Iorio MV，Ferracin M，Shimizu M，Wojcik SE，Aqeilan RI，Zupo S，Dono M，Rassenti L，Alder H，Volinia S，Liu CG，Kipps TJ，Negrini M and Croce CM.miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：13944-13949.

18Kong W，Yang H，He L，et al.MicroRNA-155 is regulated by the transforming growth factor beta/Smad pathway and contributes to epithelial cell plasticity by targeting RhoA[J].Mol Cell Biol，2008，28（22）：6773-6784.

19Burk U，Schubert J，Wellner U，et al.A reciprocal repression between ZEB1 and members of the miR-200 family promotes EMT and invasion in cancer cells[J].EMBO Rep，2008，9（6）：521-522.

20Gebeshuber CA，Zatloukal K，Martinez J.miR-29a suppresses tristetraprolin，which is a regulator of epithelial polarity and metastasis[J].EMBO Rep，2009，10（4）：400-405.

21Ma L，Teruya-Feldstein J，Weinberg RA.Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J].Nature，2007，449（7163）：682-688.

22Ma L，Young J，Prabhala H，et al.miR-9，a MYC/MYCNactivated microRNA，regulates E-cadherin and cancer metastasis[J].Nature，2010，12（3）：247-256.

23Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA exp ression p rofiles classify human cancers[J].Nature，2005，435： 834-838.

24Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：10513-10518.

25Hatley ME，Patrick DM，Garcia MR，et al.Modulation of K-Ras-dependent lung tumorigenesis by MicroRNA-21[J].Cancer Cell，2010，18（3）：282-293.

26Kluiver J，Poppema S，de Jong D，et al.BIC and miR-155 are highly expressed in Hodgkin，primary mediastinal and diffuse large B cell lymphomas[J].J Pathol，2005，207（2）：243-249.

27Garzon R，Volinia S，Liu CG，et al.MicroRNA signatures associated with cytogenetics and prognosis in acute myeloid leukemia[J].Blood，2008，111（6）：3183-3189.

28Lanford RE，Hildebrandt-Eriksen ES，Petri A，Persson R，Lindow M，Munk ME，Kauppinen S and Orum H.Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection.Science，2010，327：198-201.