局部亞低溫對再灌注治療時(shí)間窗的影響

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再灌注治療雖然是缺血性卒中的最佳治療方法，但狹窄的治療時(shí)間窗限制了其在臨床上的應(yīng)用¹。亞低溫（28～35℃）具有確切的的神經(jīng)保護(hù)手段²。為此，觀察了再灌注期內(nèi)實(shí)施亞低溫能否延長再灌注治療時(shí)間窗并觀察了Bcl-2、Bax、AQP4的表達(dá)，探討了其可能的機(jī)理。

資料與方法

動(dòng)物分組及主要試劑：將健康雄性Wistar大鼠72只隨機(jī)分為假手術(shù)組6只；大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）24小時(shí)組6只；常溫再灌注組：按再灌注時(shí)間點(diǎn)不同分為幾個(gè)時(shí)相點(diǎn)：MCAO 2、3、4、5、6小時(shí)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只；亞低溫再灌注組：時(shí)相點(diǎn)同常溫組，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只。動(dòng)物均于再灌注24小時(shí)后處死，但MCAO 24小時(shí)組大腦中動(dòng)脈閉塞24小時(shí)后直接處死。。用Koizumi改良線拴法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血/灌注模型。Bcl-2多克隆抗體（sc-492兔抗）及Bax單克隆抗體（sc-7480小鼠抗）均購自美國Santa Cruz。TUNEL試劑盒購自美國Roche。AQP4試劑盒購自武漢博士德公司。氯化三苯基四氮唑2，3，5Tripheny ltetrazoliumchloride（TTC染色劑）試劑購自Sigma。采用改良的Longa等法制備大鼠MCAO模型。

局部亞低溫方法：應(yīng)用貼敷式局部亞低溫治療儀。造模成功后，使頂部頭皮與局部亞低溫治療儀的探頭緊密接觸，采用SL-4型溫度傳感器（武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)研制）于亞低溫在10分鐘內(nèi)測大鼠鼻咽部溫度和鼓膜溫度33.6±0.5℃，表明腦溫可降至33±0.5℃。亞低溫治療時(shí)間持續(xù)5小時(shí)，同時(shí)監(jiān)測大鼠的直腸溫度和呼吸。亞低溫結(jié)束后將大鼠置于室溫（25℃）下自然復(fù)溫。

觀察梗死體積：應(yīng)用ImageJ 1.34圖像分析軟件，手工標(biāo)出梗死灶邊框，測出梗死面積及缺血側(cè)半球面積，梗死體積（mm3）=梗死面積（mm2）×厚度（m）。校正梗死體積（mm3）=左半球體積（mm3）-（右半球體積（mm3）-直接測量出的梗死體積（mm3）。為了減少大鼠個(gè)體差異造成的影響，本研究采用梗死體積占半球體積百分值（V）表示，V=校正梗死體積/缺血半球體積×100%。

用干-濕質(zhì)量法測定腦含水量：在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)將大鼠處死斷頭取腦，將大腦半球分開，分別測濕質(zhì)量，置110℃電烤箱24小時(shí)，再迅速測干質(zhì)量。腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

觀測指標(biāo)及方法：亞低溫組和常溫組在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)取材，假手術(shù)組于術(shù)后24小時(shí)取材。用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定后取腦，置于4%多聚甲醛（含1/5000 DEPC）后固定2小時(shí)，酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。連續(xù)冠狀切片，切片厚度7μm。分別進(jìn)行Bcl-2、Bax、AQP4的免疫組化、TUNEL陽性細(xì)胞檢測。檢測程序均按相應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：選取腦額頂部皮層部位，200倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)目，求其平均值。對照組凋亡細(xì)胞主要見于梗死灶及周圍的紋狀體與額頂部皮層。Bcl-2、Bax、AQP4也主要分布于梗死灶周圍的紋狀體及額頂部皮層。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所有數(shù)據(jù)均用（X±S）表示。采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

與腦梗死的近期結(jié)局MCAO 24小時(shí)組的梗死體積、Longa評(píng)分、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)、腦含水量、及Bcl-2、Bax、AQP4的表達(dá)比較：常溫組MCAO 2～3小時(shí)再灌注24小時(shí)差異有顯著性（P<0.01），MCAO 4～6小時(shí)再灌注24小時(shí)沒差異有顯著性（P>0.05）；亞低溫組MCAO 2～4小時(shí)再灌注24小時(shí)差異有顯著性（P<0.01）；MCAO 5～6小時(shí)再灌注24小時(shí)沒差異有顯著性（P>0.05）。亞低溫再灌注組各時(shí)相點(diǎn)的梗死體積、Longa評(píng)分、腦含水量、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)、Bax、AQP4的表達(dá)均顯著低于相應(yīng)常溫組，Bcl-2的表達(dá)顯著高于常溫組（P<0.01，P<0.05）。見表1、2。

討論

急性缺血性腦卒中最為有效的治療方法是缺血區(qū)的血流復(fù)灌，但治療措施必須在一個(gè)限定時(shí)間內(nèi)（即治療時(shí)間窗）進(jìn)行，因?yàn)檠舆t的再灌注會(huì)導(dǎo)致腦缺血的再灌注損傷。但現(xiàn)有研究表明血管再通治療時(shí)間窗僅3小時(shí)³，這極大的限制了再灌注治療的應(yīng)用。如何擴(kuò)展血管再通治療時(shí)間窗，已成為神經(jīng)病學(xué)急需解決的熱點(diǎn)問題。現(xiàn)有研究表明延長再灌注治療時(shí)間窗的方法有數(shù)種，但都有一定的局限性^4～7；現(xiàn)有研究亞低溫具有確切的腦保護(hù)作用，而且臨床應(yīng)用比較成熟，但缺乏其對腦缺血再灌注治療時(shí)間窗的研究。結(jié)合臨床實(shí)際即患者只可能在入院后予以大腦局部亞低溫干預(yù)，故本研究在亞低溫開始的時(shí)間點(diǎn)上選擇了在血管再通期（再灌注期）作為觀察點(diǎn)，這樣更貼近臨床實(shí)際。首先通過再灌注時(shí)間點(diǎn)不同的常溫組與腦梗死近期（24小時(shí)）結(jié)局即MCAO 24小時(shí)組的梗死體積及TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的比較，得出本組試驗(yàn)常溫下的有效再灌注治療時(shí)間窗；然后通過比較血管再通時(shí)間點(diǎn)不同的亞低溫組與MCAO 24小時(shí)組的上述指標(biāo)，得出本組試驗(yàn)在亞低溫條件下的有效再灌注治療時(shí)間窗。本研究提示，本組大鼠常溫下大腦中動(dòng)脈的再灌注治療的有效時(shí)間窗為血管閉塞后3小時(shí)。但在亞低溫干預(yù)下再灌注治療的有效時(shí)間窗為血管閉塞后4小時(shí)。結(jié)果提示再灌注期局部亞低溫能夠延長再灌注治療時(shí)間窗。

本研究結(jié)果顯示，亞低溫再灌注組各時(shí)相點(diǎn)的梗死體積、腦含水量、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)、Bax的表達(dá)均顯著低于相應(yīng)常溫組，Bcl-2的表達(dá)顯著高于常溫組（P<0.01，P<0.05）。提示亞低溫具有減輕凋亡及保護(hù)微循環(huán)的作用，即再灌注期實(shí)施亞低溫具有腦保護(hù)的作用。這與Zhang H的研究結(jié)果類似⁸。

關(guān)于再灌注期的局部亞低溫延長再灌注時(shí)間窗及其腦保護(hù)的機(jī)制，本研究首先通過Bax、Bcl-2等指標(biāo)從細(xì)胞凋亡角度進(jìn)行了探討。

體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都表明bcl-2基因可抑制各種刺激下多種細(xì)胞的凋亡。對腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡也有很強(qiáng)的抑制作用。本研究顯示亞低溫可以增強(qiáng)腦缺血后bc1-2基因的表達(dá)，而這可能是減少腦梗死的細(xì)胞凋亡進(jìn)而減少梗死體積的的一個(gè)重要原因。這與Li的等的研究結(jié)果相類似⁹。bax基因也是一種重要的凋亡調(diào)控因子，Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用，進(jìn)而促進(jìn)腦缺血后的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示再灌注期實(shí)施亞低溫能有效抑致Bax基因的表達(dá)，從而達(dá)到腦保護(hù)作用。這與Sahin等的研究結(jié)果相類似¹⁰。

故再灌注期實(shí)施亞低溫增強(qiáng)Bcl-2基因的表達(dá)，有效抑致Bax基因的表達(dá)，從而有效抑制凋亡，這可能是亞低溫延長再灌注時(shí)間窗及其腦保護(hù)的機(jī)制之一。

其次本研究對再灌注過程中血腦屏障的AQP4指標(biāo)進(jìn)行觀察。血腦屏障的完整與否，直接影響到再灌注治療的效果，它是制約再灌注時(shí)間窗長短的一個(gè)重要因素。AQP4作為水通道蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)于構(gòu)成血腦屏障重要部分的神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞足突，它與再灌注過程中出現(xiàn)的水腫及繼發(fā)出血轉(zhuǎn)化有緊密的聯(lián)系¹¹。本研究結(jié)果表明亞低溫可通過抑制AQP4表達(dá)從而減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞足突的水腫，進(jìn)而加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，保護(hù)了血腦屏障，使再灌注治療時(shí)間窗的延長成為可能。

再灌注期內(nèi)實(shí)施局部亞低溫可延長再灌注治療時(shí)間窗，這可能與其增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)抑制Bax、AQP4的表達(dá)從而抑制半暗帶細(xì)胞的凋亡及其抑制AQP4的表達(dá)以保護(hù)了腦微循環(huán)有關(guān)。

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