姜黃素對黑色素瘤B16-F10細胞增殖及線粒體凋亡影響的機制研究

摘 要 目的：探討姜黃素體外抗黑色素瘤的藥效及作用機制，為姜黃素抗腫瘤的藥理機制提供實驗依據。方法：以黑色素瘤B16-F10細胞為實驗材料，在離體水平研究姜黃素對細胞活力、細胞內活性氧水平、細胞凋亡的影響［1］。結果：姜黃素能顯著抑制B16-F10細胞增殖、促進其凋亡；姜黃素可促進B16-F10細胞活性氧水平增高，且顯著提高細胞內Caspase-4，9蛋白的表達，可能通過啟動線粒體凋亡途徑發揮促癌細胞凋亡生物活性。結論：姜黃素對黑色素瘤具有顯著抑制作用［2］，其可能的機制是通過提高細胞內活性氧水平，啟動線粒體凋亡途徑而發揮促黑色素瘤細胞凋亡的作用。

關鍵詞 姜黃素 黑色素瘤 B16-F10細胞株 線粒體凋亡

黑色素瘤是由異常黑素細胞過度增生引發的常見的皮膚腫瘤，其特點是惡性程度高、進展快、死亡率高［3］。臨床惡性黑色素瘤的治療常采用手術結合聯合化療方案［4］。本研究以黑色素瘤細胞株B16-F10為實驗材料，觀察姜黃素體外抑瘤作用。同時，以活性氧激活線粒體凋亡途徑為切入點，探討姜黃素抗黑色素瘤的可能分子機制［5］，進而推斷姜黃素的分子藥理學作用。

材料與方法

材料：姜黃素(純度≥98%)；RPMI1640、胎牛血清、HEPES、EGTA、BSA、DMSO等；MTT；DCFH-DA活性氧探針；線粒體提取試劑盒；Caspase-9(p-35，sc-8355)兔抗小鼠多克隆抗體；Caspase-4(ab-25898)兔抗小鼠多克隆抗體；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒；常規生化試劑；B16-F10小鼠皮膚黑色素瘤細胞株。

方法：①細胞培養：B16-F10細胞常規培養，每3天傳代一次，實驗時取對數生長期細胞，用0.25%Trypsin-EDTA液消化后，用培養基制成細胞懸液。②細胞生長活力測定：細胞于96孔板培養24、36、72小時；向待檢測的細胞培養板中加入MTT溶液(每孔20μl)，于CO2培養箱中孵育4小時；吸出培養板中的液體，加入100μl DMSO溶液，置于振蕩器混勻10分鐘，酶標儀在450nm波長下測OD值；采集數據，依照下列公式計算細胞生長抑制率：(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。③DCFH-DA活性氧檢測：實驗方法依照試劑盒說明進行，采用激光共聚焦顯微鏡觀察，530nm發射波長附近激發為綠色。④細胞涂片TUNEL染色、熒光顯微鏡觀察：細胞接種于6孔板(3ml/孔)，細胞接種密度4×105 cells/ml，被試藥物干預24、48小時后收集細胞、預冷的0.1M PBS洗3次，用細胞離心涂片機將細胞甩到多聚賴氨酸包被的載玻片上；4%多聚甲醛固定30分鐘、風干；1% Triton X-100 PBS透膜；加入TdT酶、熒光標記液及TUNEL檢測液、孵育60分鐘；抗熒光淬滅液封片、熒光顯微鏡觀察、攝片。⑤細胞涂片Caspase-4，9抗體免疫組織化學顯色、光鏡觀察：細胞接種于6孔板(3ml/孔)，細胞接種密度4×105 cells/ml，被試藥物干預24、48小時后收集細胞、預冷的0.1M PBS洗3次，用細胞離心涂片機將細胞甩到多聚賴氨酸包被的載玻片上；4%多聚甲醛固定、風干；1%Triton X-100 PBS透膜；正常動物血清封閉抗原；加一定稀釋度的Caspase-4，9一抗(50μl/片)，4℃濕盒孵育、過夜；加入通用型2抗PV-6001；AEC顯色(紅色)、光鏡觀察、攝片。

統計學處理：定量數據采用SPSS11.0軟件包進行統計學分析，結果以X±S表示，組間比較采用單因素方差分析，t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

姜黃素對B16-F10細胞生長抑制率的影響：用12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml四個濃度姜黃素孵育B16-F10細胞24、48和72小時，倒置顯微鏡下可觀察到隨著藥物作用時間的增加B16-F10細胞形態學的變化：細胞變圓、體積縮小、懸浮細胞(脫落)顯著增多。MTT法檢測，數據換算、統計分析結果表明姜黃素對B16-F10細胞的生長抑制存在時間和劑量的依賴性。

姜黃素對B16-F10細胞氧化損傷：依照前期實驗的結果，本實驗選擇50μg/ml的給藥劑量作用體外培養的B16-F10細胞。分別在孵育24、48小時采集細胞，采用DCFH-DA活性氧檢測試劑盒，在激光共聚焦顯微鏡下觀察姜黃素對B16-F10細胞活性氧水平的影響。結果表明姜黃素孵育48小時，能顯著增高B16-F10細胞內活性氧水平，引起細胞形態改變。與對照組比較，姜黃素孵育48小時，B16-F10細胞內活性氧自由基水平顯著增高(P＜0.01)。

姜黃素對B16-F10細胞凋亡的影響：一步法TUNEL染色，熒光顯微鏡觀察，綠色熒光示凋亡細胞。實驗結果表明姜黃素作用24小時可誘導少量B16-F10細胞凋亡，作用48小時可誘導大量B16-F10細胞凋亡，圖像分析結果顯示與空白對照組比較，姜黃素作用48小時B16-F10凋亡細胞顯著增多(P＜001)。

姜黃素對B16-F10細胞線粒體凋亡相關蛋白Caspase-4，9的影響：已知Caspase-9是誘發線粒體凋亡過程的關鍵蛋白，位于細胞的胞漿內；而Caspase-4同樣是誘發細胞凋亡的起始因子，位于內質網膜上，二者共同介導氧化應激作用誘導的線粒體凋亡過程。依照前期實驗的數據，本實驗選擇50μg/ml的給藥劑量作用體外培養的B16-F10細胞。分別在孵育24、48小時采集細胞，用離心法制備細胞涂片，行常規免疫組織化學染色，測定姜黃素對B16-F10細胞Caspase-4，9表達的影響，結果表明姜黃素干預B16-F10細胞，可顯著上調細胞內Caspase-4，9水平。

討 論

姜黃素通過誘導細胞凋亡發揮體外抗腫瘤作用：本實驗觀察到，姜黃素能夠顯著抑制黑色素瘤B16-F10細胞生長，且呈劑量和時間依賴性。該結果與桂飛等［6］的研究結果一致。細胞凋亡實驗結果表明，姜黃素具有誘導腫瘤細胞凋亡的生物活性，作用B16-F10細胞48小時可探測到大量的凋亡細胞；與線粒體凋亡相關因子caspase-4，9檢測結果表明，姜黃素作用B16-F10細胞48小時能顯著升高細胞內caspase-4，9的水平。該實驗結果初步提示姜黃素不僅直接殺傷腫瘤細胞，而且能通過誘導細胞凋亡表現為顯著的抑瘤活性。

生命體受到各種有害刺激時，體內活性氧自由基(ROS)呈增多的趨勢，稱氧化應激［7］。已有研究發現，ROS是多種藥物誘導細胞凋亡過程中的一個重要信號分子，與腫瘤形成、腫瘤治療密切相關。本研究發現，姜黃素可誘導B16-F10細胞內ROS水平的迅速增高，初步提示姜黃素可能通過誘導腫瘤細胞產生ROS，提示姜黃素誘導細胞凋亡可能通過啟動線粒體凋亡過程而實現。

參考文獻

1 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學工業出版社，2010:218.

2 Fantin VR，Leder P.Mitochondriotoxic compounds for cancer therapy［J］.Oncogene，2006，25(34):4787-4797.

3 許祖德.病理學［M］.上海:復旦大學出版社，2003.

4 Blasiak J，Trzeciak A，Malecka-Panas E，et al.DNA damage and repair in human lymPhoeytes and gastric mucosa cells exposed to chromium and curcumin［J］.Teratog Carcinog Mutagen，1999，19:19-31.

5 Kelly MR，Xu J，Alexander KE，et al.Disparate effects of similar phenolic phyto chemicals as inhibitors of oxidative damage to cellular DNA［J］.Mutat Res，2001，485:309-318.

6 桂飛，馬偉峰，蔡紹暉，等.姜黃素抗小鼠黑色素瘤分子機制的初步研究［J］.中藥材，2008，31(11):1685-1689.

7 Fantin VR，Leder P.Mitochondriotoxic compounds for cancer therapy［J］.Oncogene，2006，25(34):4787-4797.