砧木（葫蘆）種子干熱滅菌消毒處理研究

摘 要： 以砧木（葫蘆）種子為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行干熱處理，處理前后檢測(cè)種子細(xì)菌性果腐病及黃瓜綠斑駁花葉病毒的帶菌、帶毒情況，同時(shí)檢測(cè)干熱處理對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率的影響。結(jié)果表明：干熱處理可以顯著降低種子帶菌、帶毒量；同時(shí)干熱處理對(duì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)的影響在種子水分恢復(fù)到4% 時(shí)即可恢復(fù)至96%。

關(guān)鍵詞： 葫蘆； 干熱處理； 細(xì)菌性果腐病； 黃瓜綠斑駁花葉病毒； 發(fā)芽率； 發(fā)芽勢(shì)

近年來(lái)，西瓜種植的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化趨勢(shì)愈加明顯，隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，嫁接栽培逐漸成為廣大農(nóng)戶的首選，但嫁接過(guò)程中出現(xiàn)的西瓜嫁接死苗、果實(shí)壞瓤等現(xiàn)象，逐漸成為困擾廣大種植戶的突出問(wèn)題。研究表明，西瓜嫁接死苗、果實(shí)壞瓤等現(xiàn)象的產(chǎn)生與作為砧木的種子本身帶有細(xì)菌性果腐病菌、黃瓜綠斑駁花葉病毒有密切關(guān)系。現(xiàn)有的種子消毒方法主要是熱燙浸種、單一藥劑處理等，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中容易出現(xiàn)消毒不徹底、影響砧木種子芽率等問(wèn)題。2011—2012年，合肥豐樂(lè)種業(yè)股份有限公司、安徽省西瓜甜瓜工程技術(shù)研究中心對(duì)現(xiàn)在最新的種子處理手段——干熱處理的滅菌消毒效果及其對(duì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)的影響進(jìn)行了研究，干熱處理可有效避免常規(guī)處理的不足之處，不僅可以殺死種子表面附著的病菌，還可以殺死潛伏在種子內(nèi)部的病菌[1]，并鈍化病毒，起到其他種子消毒方法所達(dá)不到的效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試種子：選取檢測(cè)帶有細(xì)菌性果腐病及黃瓜綠斑駁花葉病毒的砧木（葫蘆）種子。

1.2 研究方法

1.2.1 供試種子處理 將西瓜細(xì)菌性果腐病標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋成≥106 cfu·mL-1的菌懸液，用菌懸液浸泡供試種子1 h，然后放入鼓風(fēng)干燥箱28 ℃ 烘干。

1.2.1 葫蘆種子干熱處理 供試種子按照每批次1 000粒的標(biāo)準(zhǔn)，分成3個(gè)批次，分別編號(hào)為H-1、H-2、H-3。供試種子先通過(guò)低溫烘干將水分降低至2% 以下，72 ℃ 處理12 h。處理結(jié)束后將種子進(jìn)行室內(nèi)常規(guī)貯存，等種子水分恢復(fù)至4% 的時(shí)候再次檢測(cè)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)。每個(gè)批次處理種子 1次重復(fù)。

1.2.2 西瓜細(xì)菌性果腐病檢測(cè) 供試種子在干熱處理前后分別選取1% 的種子，使用蒸餾水浸泡24 h后，直接使用種子浸出液進(jìn)行PCR檢測(cè)和電泳分析[2]。以標(biāo)準(zhǔn)菌株做陽(yáng)性對(duì)照，以非果腐病病原細(xì)菌的核酸作陰性對(duì)照，用雙蒸水代替模板DNA作為空白對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。

將種子浸出液在BFB-08，TWZ半選擇性培養(yǎng)基所制備的平皿培養(yǎng)基上劃線，每處理做3個(gè)皿，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.2.3 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢測(cè) 選取3 000粒供試種子（重點(diǎn)挑選畸形、不成熟的種子）分成每重復(fù)500粒的6次重復(fù)，其中3次重復(fù)直接播于滅菌土中，另外3次重復(fù)經(jīng)過(guò)干熱處理后再播于滅菌土中。待長(zhǎng)出3～4片葉后，每株采集1片葉片（表現(xiàn)癥狀的植株采集染病葉片），按照試驗(yàn)重復(fù)將采集的葉片混合后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[3]。以標(biāo)準(zhǔn)病毒做陽(yáng)性對(duì)照，非標(biāo)準(zhǔn)植物病毒做陰性對(duì)照，用雙蒸水代替模板DNA作空白對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干熱處理前后種子帶菌、帶毒檢測(cè)結(jié)果

種子細(xì)菌性果腐病及黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測(cè)分別參考《SN/T 1465-2004 西瓜細(xì)菌性果斑病菌檢疫鑒定方法》[2]中的常規(guī)PCR、半選擇培養(yǎng)基檢測(cè)方法和《SN/T 2344-2009 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢疫鑒定方法》[3]中的RT-PCR檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明：通過(guò)干熱處理后，原先可以檢測(cè)到帶有細(xì)菌性果腐病及黃瓜綠斑駁花葉病毒的種子（H-1、H-2、H-3同批種子）均未再次檢測(cè)到帶菌、帶毒，干熱處理可以有效殺滅種子病菌、病毒。

圖1是試樣種子的細(xì)菌性果腐病常規(guī)PCR電泳圖。由圖中可以看到，原先帶有細(xì)菌性果腐病病原的試樣H-1、H-2、H-3經(jīng)過(guò)干熱處理已不帶相關(guān)病原。同時(shí)觀察半選擇培養(yǎng)基也可以發(fā)現(xiàn)原先可以觀察到大量菌落的試樣干熱處理后無(wú)法觀察到相關(guān)菌落，僅有部分雜菌菌落存在，同時(shí)雜菌菌落數(shù)量也大幅下降。

圖2是試樣的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖中可以明顯觀察到處理后無(wú)法檢測(cè)到黃瓜綠斑駁花葉病毒擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，鑒于RT-PCR本身引物的特異性，在排除操作過(guò)程中植物組織總RNA提取失敗的情況下可以判定試樣種子處理后原帶有的黃瓜綠斑駁花葉病毒已被鈍化，在植株中不再發(fā)病。

2.2 干熱處理對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率的影響

從表1可以看出，通過(guò)干熱處理，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，處理后隨著種子水分的緩慢恢復(fù)，種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率也明顯恢復(fù)，特別是當(dāng)種子水分恢復(fù)至4%時(shí)，發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率就已恢復(fù)至處理前水平（大約96%）。

3 討 論

通過(guò)合理的干熱處理流程可以有效殺滅種子本身帶有的細(xì)菌性果腐病病原，同時(shí)鈍化黃瓜綠斑駁花葉病毒使其不再發(fā)病。細(xì)菌性果腐病和黃瓜綠斑駁花葉病毒病是現(xiàn)在嚴(yán)重危害西瓜生產(chǎn)的2種檢疫性病害，其本身可由種子攜帶傳播，并在嫁接操作中造成大面積擴(kuò)散，從而對(duì)西瓜商品化生產(chǎn)造成巨大危害。干熱處理在有效殺滅或鈍化病原的同時(shí)又不會(huì)顯著降低種子的發(fā)芽能力，因此可以說(shuō)是種子后期處理的一種有效途徑，豐樂(lè)種業(yè)已在部分產(chǎn)品上開(kāi)始應(yīng)用干熱處理滅菌消毒技術(shù)。

在試驗(yàn)過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)種子處理效果的保持易受使用環(huán)境的影響。細(xì)菌性病原主要通過(guò)接觸傳染，嫁接操作過(guò)程中，由于工具、環(huán)境等因素的影響導(dǎo)致嫁接苗帶菌一直是長(zhǎng)期困擾廣大西瓜種植戶的問(wèn)題，如何通過(guò)整體過(guò)程控制最終達(dá)到“無(wú)菌種子——無(wú)菌嫁接苗——無(wú)菌種苗”是一項(xiàng)系統(tǒng)性的工作，對(duì)其還需要進(jìn)一步研究，以尋找后續(xù)過(guò)程的全面有效的解決方案。

參考文獻(xiàn)

[1] 李明，李佐，杜翠花. 干熱處理對(duì)甜椒種攜帶真菌、細(xì)菌防效研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，20（1）： 119-121.

[2] 中華人民共和國(guó)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1465-2004 西瓜細(xì)菌性果斑病菌檢疫鑒定方法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

[3] 中華人民共和國(guó)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 2344-2009 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢疫鑒定方法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.