貴州雞源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性測定

摘 要：經分離培養采自貴州省５個地區縣級市65個規模化養雞場的1 180份樣品，生化鑒定得到839株大腸桿菌，分離率為70.89%，采用微量肉湯稀釋法測定其對9種抗菌藥物的耐藥情況。結果表明，分離菌對9種抗菌藥物具有不同程度的耐藥，土霉素、氟苯尼考和復方新諾明的耐藥率高達80%以上，對多粘菌素E、大觀霉素耐藥率相對較低。839株大腸桿菌均為多重耐藥菌株，最少的對2種藥物耐藥，最多的對9種藥物耐藥。

關鍵詞：大腸桿菌；耐藥性；微量肉湯稀釋法；最小抑菌濃度

中圖分類號：S855.1+2 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.02.00８

Identification， Isolation and Antibiotic Resistance of E.Coli from Poultry in Guizhou

WANG Guan-yu1， TAN Ai-juan1， LＹU Shi-ming2， ZHANG Jian- yong3

（1.College of Ｌife Ｓcience，Guizhou Ｕniversity， Guiyang， Guizhou 550025， China； 2. College of Ａnimal Ｓcience ，Guizhou Ｕniversity，Guiyang， Ｇｕｉｚｈｏｕ 550025， China； 3．Guizhou Province Institute of Veterinary Drug Control， Guiyang， Guizhou 550003， China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： To investigate the antibiotic resistance of E. coli isolated from poulrty in large-scale farms of Guizhou. According to the conventional method， 1 180 samples from 65 large-scale farms in five regions of Guizhou were collected， 839 E. coli strains were identified by biochemical identification method， the isolation rate was 70.98%， and were measured the MIC values to 9 kinds of antibiotics with the method of micro-broth dilution. Result demonstrated that the poulrty E. coli strains to the 9 kinds of antibiotics hanve different degrees of resistance， the resistance rates to terramycin， florfenicol and compound sulfamethoxazole were as high as 80% above， the resistance rates to polymyxin E and spectinomycin were relatively low. 839 E. coli strains were multiple drug-resistant strains， and were resistanted to at least to two kinds of antimicrobial， at most to 9 kinds of antimicrobial.

Key words： E. coli； antibiotic resistance； micro-broth dilution method； MIC

大腸桿菌是醫學和獸醫臨床感染中最常見的病原菌之一[1]，常引起腹瀉、尿道感染、腹膜炎，甚至敗血癥等。在獸醫臨床上大腸桿菌造成的危害十分嚴重，它一年四季均可致病，雞的發病率約為10%-69%，死亡率約為3.8%～72%，給養禽業造成嚴重經濟損失。大腸桿菌病發生后多采用抗生素類藥物治療，使得大腸桿菌得到一定的控制。但是抗生素的選擇壓力可導致大腸桿菌產生耐藥性[2-4]。近年來，隨著抗菌藥物在養殖業及臨床治療中的廣泛應用，大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥狀況已相當嚴重，其耐藥性逐年增長[5]。此外，耐藥菌株還可通過轉化、轉導、接合和溶原性轉化方式將其攜帶的耐藥基因轉移給其他種屬的細菌[6-7]，而大腸桿菌是腸道的常在菌群，這就使得大腸桿菌成為潛在的耐藥基因庫，不僅可以接受外來的耐藥基因，同時還可以把自身攜帶的耐藥基因轉移給其他細菌，這就加劇了細菌耐藥性的散播。

目前還沒有對貴州省雞源大腸桿菌耐藥情況的相關研究報告，為了掌握貴州省雞源大腸桿菌的耐藥現狀，對從貴州省５個地區65個規模化養雞場分離的839株大腸桿菌進行了生化鑒定和藥敏試驗，旨在為貴州省規模化養雞場臨床科學、合理、有效用藥，防治大腸桿菌感染提供參考，為相關職能部門加強管理提供依據，也為我國動物源性細菌監測提供相關數據。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑 Carry-Blair運輸培養基購自青島日水生物技術有限公司；LB肉湯、伊紅美藍瓊脂、營養瓊脂、米勒-海頓肉湯（MHB）均購自杭州博微生物技術有限公司；腸桿菌科生化編碼鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.2 藥物 氨芐西林、多粘菌素E、恩諾沙星、頭孢噻呋、慶大霉素、大觀霉素、土霉素、氟苯尼考、復方新諾明購自杭州博微生物技術有限公司。

1.1.3 質控菌株 大腸埃希氏菌質控菌株ATCC25922購買自中國菌種資源保藏中心。

1.1.4 器材 恒溫培養箱、超凈工作臺、電子天平和96孔培養板等。

1.2 方 法

1.2.1 樣品的采集 按照“五點分布”原則，從貴陽、銅仁、安順、黔南、黔西南５個地區的規模化養殖場中采集雞的肛門拭子及總排污口的新鮮糞便或污水放入無菌Carry-Blair培養基中。總樣品數為1 180份（包括總排污口的新鮮糞便或污水樣品126份）。

1.2.2 大腸桿菌的分離培養 用無菌棉簽取沾Carry-Blair培養基中的棉拭子，接種于LB肉湯培養基中，37 ℃孵育24 ｈ后，用接種環沾取大腸桿菌的LB肉湯培養物接種在伊紅美藍瓊脂培養基上，經純化后用接種環釣取呈深黑色、圓整、濕潤，中等大小并具有黃綠色金屬光澤的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，再純培養后進行生化鑒定。

1.2.3 生化鑒定 將純化的疑似大腸桿菌接種于腸桿菌科生化編碼鑒定管中，置37 ℃培養18～24 h后觀察結果。

1.2.4 藥物敏感性試驗 采用微量肉湯稀釋法測定大腸桿菌對常用9種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC），按美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2009版推薦的判定標準及中國獸醫藥品監察所標準進行耐藥性統計（表１）。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌的分離鑒定結果

分離菌在伊紅美藍瓊脂平板上形成帶有金屬光澤的紫黑色小菌落，在油鏡下對分離菌株進行觀察，可見呈短桿狀、成簇分布或散在的桿菌，革蘭染色陰性，符合大腸桿菌的形態。1 180份樣品共分離鑒定得到大腸桿菌839株，分離率為70.89%。

2.2 雞源大腸桿菌耐藥性結果

分離菌對9種常用抗菌藥物都具有不同程度的耐藥：土霉素耐藥率最高，達到86.17%，其次為氟苯尼考、復方新諾明，均達到80%以上，氨芐西林、恩諾沙星、頭孢噻呋和慶大霉素的耐藥率也都達到了60%以上，且還有增高的趨勢；多粘菌素E和大觀霉素的耐藥率相對較低，分別為51.73%和47.91%，但中介率均達到了20%以上。

2.3 多重耐藥情況

本試驗分離的839株大腸桿菌中全部為多重耐藥株，最少為3耐，占總菌株數的0.95%，5耐及5耐以上菌株占96.85%，多重耐藥性主要集中在8耐 （18.36%）。總的來看，貴州省雞源大腸桿菌的多重耐藥情況嚴重，耐藥譜型種類多，在同一耐藥類型中，有相似的耐藥譜型。

3 結論與討論

本研究為了掌握貴州省雞源大腸桿菌的耐藥現狀，為臨床合理、有效用藥提供指導，對從貴州省５個地區規模化養雞場分離鑒定得到的839株大腸桿菌進行了耐藥性調查，結果表明，貴州省雞源大腸桿菌的耐藥情況較為嚴重，多重耐藥現象不斷惡化。分離菌株對常用抗菌藥物表現不同程度的耐藥率，其中耐藥程度最強的是土霉素，耐藥率高達86.17%，敏感程度最高的是大觀霉素，耐藥率為47.91%。

本次調查結果與苑麗等[8]的報道相比，氨芐西林、頭孢噻呋、慶大霉素和恩諾沙星的耐藥率低于報道結果，而氟苯尼考的耐藥率高出30%以上。除了氨芐西林的耐藥率低于馬全朝等[9]的報道外，頭孢噻呋、慶大霉素、大觀霉素的耐藥率明顯高于其報道結果。恩諾沙星、慶大霉素、氨芐西林和復方新諾明的耐藥程度均比劉雅妮[10]等在上海分離得到的大腸桿菌的耐藥程度低，而頭孢噻呋和氟苯尼考的耐藥程度率高于其報道結果。頭孢噻呋、慶大霉素和復方新諾明的耐藥程度比Furtula[11]等從雞糞離分離得到大腸桿菌的耐藥程度強，而大觀霉素的耐藥水平比報道結果低。與 Saberfar[12]的研究結果相比，慶大霉素、氟苯尼考和氨芐西林的耐藥率明顯高于報道結果，土霉素和恩諾沙星的耐藥率略低于報道結果。氨芐西林的耐藥率與Randall等[13]的報道結果相近，而復方新諾明和頭孢類藥物明顯高于報道結果。不同國家、地區雞源大腸桿菌的耐藥性有所差異，這與不同國家地區養殖場在飼養中的用藥習慣和用藥的種類、頻率不同有關。由此可見，養殖場應根據雞場實際情況合理、謹慎用藥，嚴格按照藥物標識正確使用藥物；利用空間增效劑與某些抗菌藥物的協同作用聯合用藥，減少或延緩耐藥菌株的產生；應盡量避免同一種或同幾種藥物長期使用，以免影響治療效果及細菌耐藥性的產生；也可考慮應用中草藥防治動物疾病。此外，有關部門應該重視用藥管理，加強臨床抗菌藥物的指導和監管，加強細菌耐藥性知識的培訓和宣傳，定期對管轄區域的養殖場耐藥情況進行監測和分析。

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