缺血后處理激活自噬保護皮瓣機制研究

[摘要]目的：缺血后處理皮瓣在臨床上已經運用，開始相關研究探究缺血后處理對皮瓣保護機制。方法：健康成年新西蘭大白兔，分為3組。A組為給予缺血后處理；B組為再灌注前5min給予自噬阻滯劑3-甲基腺嘌呤 10μl +缺血后處理。C組，直接應用微血管夾阻斷腹壁淺血管持續缺。6h后再灌。各組分別進行自噬指標Beclin1、LC3 免疫組化和皮瓣存活率檢測。結果：新西蘭大白兔完全存活。B、C組相比較，自噬Beclin1、LC3 免疫組化染色陽性細胞面積變化未見統計學差別（P>0.005）。實驗組皮瓣存活面積比較， B 與C相比較，無統計學意義（P>0.005），但是A與B、C相比較，上述指標兩兩之間都有統計學意義差別（P<0.005）。結論：缺血后處理對皮瓣再灌注損傷有保護作用，該作用可能和自噬激活有關。

[關鍵詞]皮瓣；缺血-再灌注損傷；自噬

[中圖分類號]R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）02-0261-03

近年， 缺血再灌注損傷的防治逐漸成為眾多學者關注的熱點。自2004年zhao 等學者提出了缺血后處理概念， 并且通過一系列動物實驗證實后處理具有心肌，肌肉等保護作用[1]。內皮細胞是皮瓣再灌注損傷的關鍵靶點之一。缺血后處理和血管內皮細胞保護有關[2]。最近研究發現缺血再灌注損傷中激活自噬有保護內皮細胞穩態的作用[3]。缺血后處理保護皮瓣作用是否和激活自噬有關，筆者將進行相關研究 以論證該假說。

1 材料和方法

1.1 動物模型的建立：選用健康成年新西蘭大白兔24只， 雌雄不限， 體重2.5～3.5kg。以3%異戊巴比妥鈉（1ml/kg）耳緣靜脈注射，麻醉后以仰臥位固定，全腹部備皮后制取左側腹股溝皮瓣約4cm×8cm，以腹壁淺血管為蒂，保留血管蒂。

1.2 實驗方法與分組：24只大白兔模型建立后， 用隨機數字表法平均分成3組，每組8只。對照組為C組，誘導再灌注損傷時首先微血管夾阻斷腹壁淺血管缺血6h恢復正常血供；實驗組持續缺血再灌注后按照前期的研究設定給予短暫缺血再灌注處理（10s缺血+10s再灌注為一個療程，共6個療程，持續2min）。按照自噬抑制劑使用的方式繼續分為2組：A組為給予缺血后處理；B組為再灌注前5min給予腹壁淺靜脈給予自噬抑制劑3一甲基腺嘌呤10μl缺血后處理。A，B組處理后實驗步驟與對照組相同。在圍實驗期血管蒂注意保溫防止痙攣。

1.3標本收集與檢測：每組兔子恢復血流4h后， 取2只處死，甲醛固定皮瓣組織后HE染色下觀察下觀察。Abgent 公司的兔抗人微管相關蛋白輕鏈3（MAP1- LC3）多克隆抗體 ，Santa Cruz 公司的兔抗人自噬基因Beclin1 多克隆抗體。福建邁新生物制品公司的辣根過氧化酶標記山羊抗兔二抗體， DAB 顯色。PBS 緩沖液代替一抗作為空白對照。以細胞胞漿棕黃染為陽性；顯微數字圖像分析系統采集、分析免疫組化結果。

其余6 只動物于術后1周判斷皮瓣成活情況，計算皮瓣成活面積的百分比。

1.4 統計學方法：SPSS11.0行統計處理， 數據以均數±標準差（x±s）表示。實驗組與對照組比較采用t檢驗，P<0.05 為有統計學意義

2 結果

2.1 大體觀察：手術中和手術后1周內所有的新西蘭大白兔均存活。皮瓣恢復灌注24h內， C組皮瓣遠端大部分組織迅速腫脹淤紫，指壓毛細血管反應消失，以后皮瓣兩邊逐漸發黑。術后7天壞死界限明確。A實驗組皮瓣兩側邊緣部分出現腫脹，色澤偏暗，指壓毛細血管回流稍遲緩，一周后兩側皮瓣邊緣部分失活。B，C組肉眼觀察形態變化接近。

2.2皮瓣Beclin1、LC3免疫組化染色陽性細胞比較：B、C組相比較，Beclin1及LC3免疫組化染色陽性面積也未見統計學差別（P>0.05）。但是A與B、C相比較，兩兩之間都有統計學意義差別（P<0.05）（見圖1）。

2.3皮瓣存活面積：實驗組A和B 與C相比較，均有統計學意義（P<0.05），皮瓣存活面積提高了2倍左右。但是B和C組相比較，成活面積雖然稍有提高，但是差別無統計學意義（P>0.05）（見表1）。

3 討論

目前缺血后恢復灌注對皮瓣的危害越來越引起重視，再灌注后皮瓣損傷除了沒有恢復以外，反而呈現進行性加重。但是缺血再灌注損傷的發生機制尚不完全清楚。自由基損傷常被看成缺血一再灌注損傷的主要原因之一，但抗自由基治療的效果不理想。細胞凋亡也被認為是引起缺血再灌注損傷的一個重要原因[4]。如何預防和減輕組織缺血再灌注損傷，防止凋亡是當前醫學研究的重要課題之一。

缺血后處理是通過一次或多次短暫缺血，再灌注過程而減輕組織再灌注損傷的發生的新的機械性干預措施，應用于再灌注早期。具有可預知性和可控制性的特點， 而且臨床應用簡單、方便、可行， 易為外科醫生所接受。雖然缺血后處理已在皮瓣中應用[5-7]，但其保護機制仍然不明確。

自噬是一種存在于正常細胞和病態細胞中非選擇性的降解機制， 其活化通常發生在應激狀態下， 有兩個主要作用：①在營養缺乏的情況下為細胞生長代謝提供必要的大分子物質和能量；②清除細胞內過剩或有缺陷的細胞器。自噬發生早于凋亡[9-10]。自噬對細胞凋亡有抑制作用11。由此筆者設想自噬激活可能是缺血后處理保護皮瓣的重要機制。

筆者的研究著重探討缺血后處理對新西蘭大白兔腹股溝皮瓣再灌注損傷的影響并且研究自噬在缺血后處理保護皮瓣機制中作用，并通過對分組處理皮瓣進行大體觀察，術后7天測量皮瓣面積，研究相關的自噬指標變化。抑制細胞自噬可以抵消皮瓣的缺血后保護作用。結果證實了缺血后保護機制的激活，預防皮瓣再灌注損傷和自噬有關。但缺血后處理調節自噬的具體機制還不明確。后續的實驗中將進一步探討缺血后保護游離皮瓣激活自噬有效途徑，研究自噬和細胞凋亡互相影響的機制關系。

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[收稿日期]2012-11-10 [修回日期]2013-01-25

編輯/張惠娟