口腔念珠菌的分離及鑒定

念珠菌這個(gè)詞起源于拉丁語“Candid”，意為白色的。念珠菌是具有二相性的真菌，孢子相是無致病性的，而當(dāng)菌群失調(diào)或機(jī)體的抵抗力降低時(shí)，念珠菌就會產(chǎn)生具有侵入性以及致病力的假菌絲[1]。念珠菌作為內(nèi)源性的共生菌，它的致病過程受很多因素影響，這不同于致病微生物以自身的毒力作為唯一的關(guān)鍵因素在致病過程中起作用。念珠菌是機(jī)會致病菌，因此無論是淺表真菌感染還是系統(tǒng)真菌感染都與機(jī)體生理狀態(tài)有關(guān)[2]。念珠菌種有很多成員，臨床常見的致病念珠菌包括白色念珠菌，光滑念珠菌，都柏林念珠菌，吉利蒙念珠菌，葡萄牙念珠菌，近平滑念珠菌，乳酒念珠菌，克柔念珠菌，熱帶念珠菌[3]。但是口腔中檢出最多的還是白色念珠菌，包括帶菌狀態(tài)和感染狀態(tài)，估計(jì)白色念珠菌占口腔檢出念珠菌的80%，近年來非白念的比例有增高的趨勢。在對人類致病性上，除了白色念珠菌，非白色念珠菌的重要性越來越多的得到公認(rèn)。光滑念珠菌和克柔念珠菌被認(rèn)為對某些抗真菌藥物的耐藥性增強(qiáng)。都柏林念珠菌是最近才發(fā)現(xiàn)的致病菌，1995年，首次在HIV感染者的念珠菌性口腔粘膜炎癥患者的口腔標(biāo)本中共同分離出白色念珠菌和都柏林念珠菌。隨著HIV感染人群的增多以及抑制免疫的化療藥物的廣泛應(yīng)用，人們對條件致病的真菌越來越重視[4]。因此，對念珠菌種的分離鑒定不僅可以進(jìn)一步了解它的致病力，還可以知道該菌對抗真菌藥物敏感性，具有重要意義[5-6]。本文對口腔標(biāo)本中念珠菌的分離和鑒定方法做一個(gè)全面的回顧。

1 念珠菌的致病力

念珠菌由非致病狀態(tài)向致病狀態(tài)轉(zhuǎn)換的過程是復(fù)雜的，微妙的環(huán)境變化會導(dǎo)致其許多毒力因子的表達(dá)，這是宿主與菌體共同作用的結(jié)果，導(dǎo)致口腔念珠菌病的發(fā)生發(fā)展。無論患什么類型的念珠菌病，念珠菌只有能夠停留在健康個(gè)體的粘膜表面才能發(fā)揮致病力，這一點(diǎn)在口腔尤為重要，因?yàn)榭谇粌?nèi)的微生物每天都要對抗相對穩(wěn)定的唾液的機(jī)械沖刷作用[7]。盡管有大量因素被證明可以促進(jìn)念珠菌致病，但是沒有一個(gè)是獨(dú)立的致病因素。這些造成宿主細(xì)胞損傷的因素包括：念珠菌粘附相關(guān)因素（表面疏水性，粘附分子等），抵抗宿主的免疫（快速的表性轉(zhuǎn)換，菌絲生長，補(bǔ)體分子粘附），釋放水解酶（磷脂酶，天冬酰胺蛋白酶）。

2 口腔黏膜念珠菌病

Samaranayake提出把口腔黏膜念珠菌病分成兩類：一類是原發(fā)的口腔黏膜念珠菌病，病變局限在口腔黏膜，不累及皮膚及其他黏膜；另一類是繼發(fā)口腔黏膜念珠菌病，病損不僅存在于口腔黏膜還累及口外部位，如皮膚等，這類疾病通常與免疫系統(tǒng)缺陷有關(guān)，臨床上較不常見。第一類病損包括三種經(jīng)典類型：偽膜型，紅斑型以及增生型，增生型還被細(xì)分為斑塊型和結(jié)節(jié)型[8]。

3 口腔黏膜念珠菌病的診斷

口腔粘膜念珠菌病的診斷經(jīng)常要靠臨床特征，但是如果可能對樣本進(jìn)行微生物學(xué)檢測則有助于定性及定量診斷念珠菌病，并且還可以對致病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

4 口腔念珠菌的分離方法

口腔念珠菌的分離方法包括：涂片法，棉拭子法，印跡培養(yǎng)法[9]，全唾液收集培養(yǎng)[10]，漱口水濃縮培養(yǎng)[11]以及活檢。每種方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)，取樣方法的選擇取決于病損局部的狀況。確立病損且容易暴露的創(chuàng)面適合棉拭子或者印跡培養(yǎng)法直接取材，因?yàn)檫@樣可以準(zhǔn)確提供病損部位的微生物信息。而病損不明顯或者病損部位隱匿不容易直接取材者適合唾液培養(yǎng)或者漱口液濃縮培養(yǎng)。對于念珠菌負(fù)荷的定量可以采用印記培養(yǎng)、漱口水培養(yǎng)法來計(jì)數(shù)，以區(qū)分念珠菌帶菌狀態(tài)或者感染狀態(tài)，如果念珠菌高負(fù)荷則考慮后者。Silverman等[12]將500CFU/mL漱口液作為臨界參考值，這說明口腔念珠菌負(fù)荷大于500CFU/mL漱口液時(shí)，患者都出現(xiàn)口腔念珠菌病表現(xiàn)，國內(nèi)徐巖英等則以菌落數(shù)大于300CFU/ml漱口液定為念珠菌感染。

5 直接鏡檢

念珠菌的形態(tài)特征可作為鑒定的一方面，涂片可用于區(qū)分酵母樣和菌絲體，比培養(yǎng)法敏感性[13]。KOH處理過的標(biāo)本可顯示出無色的帶有45°分叉的菌絲。KOH標(biāo)記熒光染料后，菌絲、酵母菌以及其他的菌體成分都會發(fā)熒光[14]。從病損局部取材的涂片經(jīng)吉姆薩染色后，念珠菌的菌絲和酵母菌顯示深藍(lán)色；經(jīng)過碘酸雪夫染色則顯示紅色或紫色[15]。對于慢性增生性粘膜念珠菌病，病損部位活檢可經(jīng)過碘酸雪夫染色或者六亞甲基四胺銀染判斷真菌侵入的深度，菌體成分被深染。真菌孢子、菌絲及假菌絲的存在就可以診斷感染真菌為念珠菌屬，結(jié)合組織病理學(xué)特征則可以診斷為慢性增生性念珠菌[16]。

6 實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

6.1 棉拭子法：病損局部的棉拭子法是相對簡單的方法，用來檢測念珠菌的生長以及半定量，取材方法為用滅菌的棉拭子輕輕地涂搽病損局部然后接種在沙氏平板培養(yǎng)基上[17]。

6.2漱口法：讓患者用10mlPBS（0.01M，pH7.2）含漱1min吐出，然后經(jīng)10倍離心濃縮后取50μL接種于沙氏瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48h后計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算每毫升漱口水的念珠菌克隆形成[13]。

6.3印跡培養(yǎng)法：印跡法采用無菌的泡沫板（一般2.5cm），使用前浸泡在沙氏肉湯液體培養(yǎng)基中，然后放在口內(nèi)病損部位停留30s，后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)[17]。

7 培養(yǎng)基

念珠菌培養(yǎng)的初級培養(yǎng)基是沙氏（SDA）培養(yǎng)基[18]，因?yàn)槠鋚H值較低，可抑制口腔細(xì)菌的生長而有利于念珠菌生長，在培養(yǎng)基中加入抗生素可進(jìn)一步增強(qiáng)這種選擇性。一般培養(yǎng)條件為37℃、有氧環(huán)境，培養(yǎng)24～48h后，念珠菌會在SDA培養(yǎng)基上形成的菌落呈奶油狀、表面光滑、白色突起有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深 。但是無法進(jìn)行種間鑒別。據(jù)估計(jì)大約10%的口腔樣本存在一種以上的念珠菌，因此對非白色念珠菌的鑒別能力逐漸變得更為重要[13]。

近年來，許多不同的鑒定培養(yǎng)基被開發(fā)出來，可以根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色區(qū)分不同菌種，這種培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于可以用來鑒別混合感染的標(biāo)本。這類培養(yǎng)基包括：Pagano-Levin 瓊脂培養(yǎng)基和許多商品化的顯色培養(yǎng)基：（如：CHROMagar Candida，Albicans ID，F(xiàn)luroplate，Candichrom albicans）[13]。Pagano- Levin瓊脂培養(yǎng)基鑒別念珠菌是基于其還原氯三苯四唑的特點(diǎn)，該培養(yǎng)基上生長的白色念珠菌為蒼白色菌落，而與其他念珠菌的菌落為不同程度的粉色相區(qū)分。Pagano-Levin培養(yǎng)基與SDA培養(yǎng)基敏感度相似，但是因?yàn)榭蓞^(qū)分一種以上的念珠菌而優(yōu)于SDA培養(yǎng)基[19]。CHROMagar Candida 培養(yǎng)基可根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色鑒別白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌[20]。Albicans ID和Fluroplate對白色念珠菌的鑒定更有優(yōu)勢[21]。CHROMagar Candida對白色念珠菌的鑒定準(zhǔn)確率為95%[22]，而Albicans ID和Fluroplate的準(zhǔn)確率為98.6%[21]。CHROMagar Candida 培養(yǎng)基作為初步分離的培養(yǎng)基據(jù)說可以將新發(fā)現(xiàn)的都柏林念珠菌與白色念珠菌相鑒別[23]，據(jù)報(bào)導(dǎo)前者的菌落顏色為深綠色從而與白色念珠菌相區(qū)分[24]。但是，在傳代培養(yǎng)或者標(biāo)本保存后培養(yǎng)時(shí)兩者的區(qū)別會變得不明顯。最近發(fā)現(xiàn)都柏林念珠菌無法在45℃孵化條件下生長，可以此來與白色念珠菌相鑒別[25]。

8 念珠菌的鑒定

8.1 形態(tài)鑒定：芽管實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室鑒定白色念珠菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，該實(shí)驗(yàn)包括在馬血清培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)2～4h誘導(dǎo)菌絲（芽管）產(chǎn)生，大約95%的白色念珠菌都會產(chǎn)生芽管，星形念珠菌和都柏林念珠菌也具有這項(xiàng)特性[13]。白色念珠菌與都柏林念珠菌能夠產(chǎn)生特征性形態(tài)-厚壁孢子，依此可與其他念珠菌相區(qū)別。厚壁孢子是真菌在營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基上如玉米瓊脂培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)時(shí)，在菌絲末端形成的反光的球形結(jié)構(gòu)。可在37℃孵育24～48h后鏡檢厚壁孢子形成情況。

8.2 生理生化鑒定：生化鑒定主要基于真菌生長時(shí)利用碳水化合物的情況，在傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)中基本的瓊脂培養(yǎng)基缺乏碳源，碳水化合物溶液被加在已經(jīng)接種標(biāo)本的瓊脂培養(yǎng)基的小孔中或者瓊脂表面的濾紙片上。若碳源周圍有生長則代表利用碳水化合物，商品化的鑒定系統(tǒng)也是基于這個(gè)原理，只是碳水化合物實(shí)驗(yàn)被局限在檢測條上的一排小孔中，在特定的鑒定體系中每個(gè)孔的生長情況根據(jù)濁度或者顏色該變來讀取，實(shí)驗(yàn)得到的大量結(jié)果通過數(shù)據(jù)比較得出鑒定結(jié)果[26]。

8.3血清學(xué)鑒定：血清學(xué)檢測常常被用來明確念珠菌的臨床特征，白色念珠菌的IgG抗體滴度增加也許反映具有免疫能力的個(gè)體正在經(jīng)受侵入性真菌的感染。IgA和IgM抗體的檢出是反映急性感染的指標(biāo)，免疫缺陷個(gè)體抗體滴度變化很大。因此，在這種情況下推薦抗原檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）或者放射免疫分析（RIA）可用于檢測念珠菌的抗原，在發(fā)達(dá)國家念珠菌的細(xì)胞壁甘露聚糖或者細(xì)胞質(zhì)的成分都可作為抗原檢測的目標(biāo)[27]。血清學(xué)診斷經(jīng)常是滯后的，并且缺乏敏感性和特異性。而且，免疫缺陷患者，抗體產(chǎn)生變化很大，使得診斷更加復(fù)雜[28]。這主要是因?yàn)檎婢乖按x產(chǎn)物會很快地被機(jī)體從循環(huán)系統(tǒng)清除掉，而抗體的存在并不能代表真菌感染，尤其對于那些有嚴(yán)重潛在疾病或者服用免疫抑制藥物的患者[29]。深部真菌感染患者通常伴有機(jī)體免疫應(yīng)答功能的嚴(yán)重低下，所產(chǎn)生的抗體效價(jià)較低，且真菌之間存在交叉抗原，不可避免地存在假陽性和假陰性，限制了血清學(xué)試驗(yàn)在真菌感染診斷上的應(yīng)用。

血清學(xué)實(shí)驗(yàn)無法用來診斷口腔念珠菌病，然而可以用來推測預(yù)后，尤其對于那些患嚴(yán)重口腔念珠菌病且對抗真菌治療效果不佳的患者[30]。

8.4分子鑒定：目前飛速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)為病原真菌的生物學(xué)特性研究提供了可能，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測方法自 1984 年創(chuàng)立以來，已經(jīng)成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的核心技術(shù)，在對于醫(yī)學(xué)重要真菌的檢測中，PCR 技術(shù)及其相關(guān)技術(shù)占據(jù)了重要位置，并且不斷被應(yīng)用于真菌感染的診斷和菌種鑒定中，可以使感染菌種的確立與快速診斷進(jìn)一步完成。通過分析遺傳變異性來鑒定比通過表型鑒定更可靠。因?yàn)槟钪榫倪z傳變異性的鑒定是分析通過凝膠電泳或者DNA-DNA雜交得到的電泳核型的差異、限制性片段長度多態(tài)性來實(shí)現(xiàn)的[13]。很多種屬特異的PCR方法被用于念珠菌的種間鑒定。盡管最經(jīng)常被擴(kuò)增的基因是核糖體RNA操縱子，據(jù)報(bào)道有幾個(gè)靶基因可用于念珠菌的種間鑒別，通過凝膠電泳分離的PCR產(chǎn)物大小、直接測序或者經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物酶切后進(jìn)行限制性片段分析來了解基因序列的變化。利用肽核酸方法的熒光原位雜交（PNA Fish）可以瞄準(zhǔn)活的白色念珠菌菌體內(nèi)充足的rRNA上高度保守的種屬特異的序列，活的菌體可不用經(jīng)過擴(kuò)增直接進(jìn)行檢測[31]，這項(xiàng)技術(shù)的準(zhǔn)確率為98.7%～100%，特異性為100%[32]。基于分子水平的技術(shù)也可用來鑒定念珠菌種型，例如：脈沖場凝膠電泳（PFGE）、隨機(jī)擴(kuò)增多肽DNA（RAPD）分析、重復(fù)序列擴(kuò)增PCR（REP），這些技術(shù)在口腔念珠菌病的流行病學(xué)研究方面被廣泛應(yīng)用。

9 小結(jié)

近年來，對于臨床采集的念珠菌標(biāo)本的鑒定越來越重視，本文將念珠菌的分離與鑒定程序用模式圖的方式做圖表總結(jié)（見圖1）。既然念珠菌是口腔常駐菌，必須有合適的方法來確定它的存在及判斷真菌的負(fù)荷。鑒定感染的念珠菌的種型更為重要，因?yàn)槟钪榫姆N型很多，并且不同種型念珠菌在致病性和對抗真菌藥物的敏感性方面有所不同。目前，可以通過芽管誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，顯色培養(yǎng)基鑒定，生化鑒定來進(jìn)行種屬鑒定。另外，還有廣泛用于流行病學(xué)研究的分子分型技術(shù)作補(bǔ)充。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Zunt SL. Oral candidiasis： diagnosis and treartment[J]. J Practic Hygiene，2000，9（2）：31-36.

[2]Soysa NS，Samaranayake LP，Ellepola ANB.Antimicrobials as a contributory factor in oral candidosis-a brief overview[J].Oral Diseases，2008，14（2）：138-143.

[3]Scully C，Ei-Kabir M，Samaranayake LP.Candida and oral candidosis： a review[J].Crit Rev Oral Biol Medi，1994，5（2）：125-157.

[4]Epstein JB，Komiyama K，Duncan D.Oral topical steroids and secondary oral candidiasis[J].J Oral Med，1986，41（4）：223-227.

[5]Allen CM，Saffer A，Meister RK，et al.Comparison of a lesion-inducing isolate and a nonlesional isolate of Candida albicans in an immunosuppressed rat model of oral candidiasis[J].J Oral Pathol Med，1994，23（3）：133-139.

[6]McIlroy MA.Failure of fluconazole to suppress fungemia in a patient with fever， neutropenia and typhlitis[J].J Infecti Diseases，1991，163（2）：420-421.

[7]Sitheeque MAM，Samaranayake LP.Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis （candidal leukoplakia）[J].Critical Reviews in Oral Biology and Medicine，2003，14（4）：253-267.

[8]Holmstrup P，Bessermann M.Clinical， therapeutic， and pathogenic aspects of chronic oral multifocal candidiasis[J].Oral Surg Oral Medi Oral Pathol，1983，56（4）： 388-395.

[9]Davenport JC.The oral distribution of Candida in denture stomatitis[J]. Bri Dent J， 1970，129（4）：151-156.

[10]Oliver DE，Shillitoe EJ.Effects of smoking on the prevalence and intraoral distribution of Candida albicans[J].Journal of Oral Pathology，1984，13（3）：265-270.

[11]Samaranayake LP，MacFarlane TW，Lamey PJ，et al.A comparison of oral rinse and imprint sampling techniques for the detection of yeast， coliform and Staphylococcus aureus carriage in the oral cavity[J].J Oral Pathol，1986，15（7）：386-388.

[12]Silverman SJr，Gallo JW，Mcknight M，et al.Clinical characteristicsand management responses in 85 HIV-infected patients with oral candidiasis[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Pathol Oral Radjol Endod，2005，83（4）：402.

[13]Williams DW，Lewis MAO.Isolation and identification of Candida from the oral cavity[J].Oral Diseases， 2000，6（1）：3-11.

[14]Harrington BJ，Hageage GJ.Calcofluor white： tips for improving its use[J].Clinical Microbiology Newsletter，1991，13（1）：3-5.

[15]Davenport JC，Wilton JMA.Incidence of immediateand delayed hypersensitivity to Candida albicans in denture stomatitis[J].J Dent Res，1971，50（4）：892-896.

[16]Nassar A，Zapata M，Little JV，et al.Utility of reflex gomori methenamine silver staining for Pneumocystis jirovecii on bronchoalveolar lavage cytologic specimens： a review[J].Diagnostic Cytopathology，2006，34（11）： 719-723.

[17]Axell T，Simonsson T，Birkhed D，et al .Evaluation of a simplified diagnostic aid（Oricult-N） for detection of oral candidoses[J].Scandinavian J Dent Res，1985，93（1）：52-55.

[18]Odds FC.Sabouraud（'s） agar[J].J Med Veterin Mycol，1991，29：355-359.

[19]Samaranayake LP，MacFarlane TW，Williamson MI.Comparison of Sabouraud dextrose and Pagano-Levin agar media for detection and isolation of yeasts from oral samples[J].J Clin Microbiol，1987，25（1）： 162-164.

[20]Beighton D，Ludford R，Clark DT，et al.Use of CHROMagar Candida medium for isolation of yeasts from dental samples[J].J Clini Microbiol，1995，33（11）：3025-3027.

[21]Rousselle P， Freydiere AM，Couillerot PJ，et al.Rapid identification of Candida albicans by using albicans ID and fluoroplate agar plates[J].J Clini Microbiol，1994，32（12）： 3034-3036.

[22]Pfaller MA，Houston A，Coffmann S.Application of CHROMagar Candida for rapid screening of clinical specimens for Candida albicans， Candida tropicalis， Candida krusei， and Candida （Torulopsis） glabrata[J]. J Clin Microbiol，1996，34（1）： 58-61.

[23]Sullivan DJ，Westerneng TJ，Haynes KA，et al.Candida dubliniensis sp. nov.： phenotypic and molecular characterization of a novel species associated with oral candidosis in HIV-infected individuals[J]. Microbiology，1995，141（7）：1507-1521.

[24]Schoofs A，Odds FC，Colebunders R，et al.Use of specialised isolation media for recognition and identification of Candida dubliniensis isolates from HIVinfected patients[J].European J Clini MicrobiolInfect Diseases，1997，16（4）：296-300.

[25]Pinjon E，Sullivan D，Salkin I，et al.Simple， inexpensive， reliable method for differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans[J].J Clin Microbiol，1998，36（7）：2093-2095.

[26]Ellepola ANB，Morrison CJ.Laboratory diagnosis of invasive candidiasis[J]. J Microbiol， 2005，43：65-84.

[27]Aubert D，Puygauthier-Toubas D，Leon P，et al.Characterization of specific anti-Candida IgM， IgA and IgE： diagnostic value in deep-seated infections[J].Mycoses，1996，39（5）：169-176.

[28]Wahyuningsih R，F(xiàn)reisleben HJ，Sonntag HG，et al.Simple and rapid detection of Candida albicans DNA in serum by PCR for diagnosis of invasive candidiasis[J].J Clin Microbiol，2000，38（8）： 3016-3021.

[29]Yeo SF，Wong B.Current status of nonculture methods for diagnosis of invasive fungal infections[J]. Clin Microbiol Rev，2002，15（3）： 465-484.

[30]Budtz-Jorgensen E.Histopathology， immunology， and serology of oral yeast infections. Diagnosis of oral candidosis[J].Acta Odontologica Scandinavica，1990，48（1）：37-43.

[31]Shepard JR，Addison RM，Alexander BD，et al.Multicenter evaluation of the Candida albicans/Candida glabrata peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization methodfor simultaneous dual-color identification of C. albicans and C. glabrata directly from blood culture bottles[J].J Clin Microbiol，2008，46（1）：50-55.

[32]Trnovsky J，Merz W，Della-Latta P，et al.Rapid and accurate identification of Candida albicans isolates by use of PNA FISHFlow[J].J Clin Microbiol，2008，46（4）：1537-1540.

[收稿日期]2012-10-13 [修回日期]2012-12-09

編輯/李陽利