繡球菌多糖的提取與抗氧化活性研究

摘 要：采用微堿法提取繡球菌多糖，通過單因素分析和L9（34）正交試驗探究提取溫度、提取時間、pH值、料液比4個因素對多糖提取率的影響；同時利用體外鄰苯三酚自氧化法和smirnoff法對多糖進行抗氧化活性的測定。微堿法提取繡球菌多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度60 ℃、提取時間2 h、提取液pH值9、料液比為1∶30。此條件下的多糖提取率為1.7%。多糖在0.06 mg·mL-1時對羥自由基清除率達到最大，為10.5%；在0.08 mg·mL-1時對超氧陰離子自由基清除率達到最大，為21.5%。繡球菌有望成為天然的抗氧化藥用真菌。

關鍵詞：繡球菌；多糖；微堿法；抗氧化

中圖分類號：Q629.12 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.003

Extraction and Antioxidant Activity of a Polysaccharide from Sparassis crispa

YU Guo-long，YE Lin，YUAN Shi-ting，ZHANG Li-xia

（College of Life Sciences，Daqing Normal College， Daqing，Heilongjiang 163712，China）

Abstract： With meningococcal polysaccharide extraction by alkali method， through the single factor analysis and L9（34） orthogonal experiment of extraction temperature， extraction time， pH value， solid to liquid ratio of four factors on the extraction rate of polysaccharide；while using in vitro adjacent benzene three phenol from determination of oxidation method and Smirnoff method were antioxidant activity of polysaccharides. The alkali extraction optimum extraction conditions of Sparassis crispa for polysaccharides extraction temperature 60 ℃， extraction time 2 h， extraction pH value 9， the ratio of solid to liquid 1∶30， polysaccharide under this condition the extraction rate of 1.7%. Polysaccharide in 0.06 mg·mL-1 on the hydroxyl radical scavenging rate reached the maximum at 0.08 mg·mL-1 10.5%， on superoxide anion free radical scavenging rate reached a maximum of 21.5%. Sparassis crispa was expected to become the natural antioxidant medicinal fungi.

Key words： Sparasis crispa.； polysaccharide； micro alkali； antioxidant

繡球菌（Sparassis crispa Fr.） 又名繡球蘑，屬無隔擔子菌亞綱、無褶菌目、繡球菌科、繡球菌屬 [1] ，是一種非常珍稀名貴的藥食兩用菌。多糖是繡球菌的主要活性成分，尤其是葡聚

糖的含量可達40%～50%，具有抗氧化、防癌抗癌、延年益壽和增強免疫的功能[2-3]。目前，對繡球菌多糖的研究主要集中在培養栽培和水溶多糖上，通過微堿法提取多糖并對其抗氧化活性的深入系統研究卻鮮見報道。筆者采用微堿法對繡球菌多糖進行提取工藝條件優化及抗氧化活性研究，旨在為繡球菌資源的開發利用提供可靠的試驗依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

繡球菌子實體購自浙江磐安山村儂農特產有限公司。

1.2 主要試劑

95%乙醇、無水乙醇、乙醚、NaOH、葡萄糖、氯仿、正丁醇、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、tris-HCL、濃硫酸、苯酚、鄰苯三酚、鹽酸、乙二胺四乙酸、考馬斯亮藍G250、牛血清蛋白（sigma）、葡聚糖（sigma）。所有試劑均為市售分析純。

1.3 試驗儀器

BS 124S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），NR-C26WF1冰箱（松下公司），通風櫥（北京森雷博瑞實驗室設備有限公司），HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），PDZ5-WS低速多管架自動平衡離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），752N紫外可見分光光度計（上海科學精密儀器廠），真空干燥器，PHS-25型 數顯酸度計（上海天達儀器有限公司），DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 多糖的提取流程 繡球菌子實體烘干→粉碎→堿液浸泡過夜→提取（3次）→合并濾液→濃縮→脫蛋白（Sevage法）→離心（3 000 r·min-1，

10 min） →透析→醇沉（3倍體積95%乙醇）→洗滌（乙醇、乙醚）→干燥→粗多糖。

1.4.2 Sevage法脫游離蛋白[4-6] 將粗多糖配制成5%的飽和溶液與 Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1（v/v））以4∶1的比例混強力振蕩后離心，去除變性的蛋白質，介于提取液與 Sevage試劑交界處，反復做至無游離蛋白為止。

1.4.3 多糖中蛋白質含量的測定-考馬斯亮蘭法[7-9] 繪制標準曲線，進行樣品測定。用測得的吸光值從標準曲線上查得相當于牛血清白蛋白的微克數，計算出待測蛋白質的含量。 樣品中蛋白質含量=（所測得的蛋白質濃度×稀釋倍數）/樣品質量×100%。

1.4.4 多糖含量測定-酚硫酸法[5] 繪制標準曲線，得回歸方程和線性范圍。利用回歸方程計算出樣品中得多糖含量，計算樣品中多糖的提取率。多糖提取率=多糖濃度×多糖質量/原料重量×100%。

1.4.5 多糖提取工藝條件優化 多糖提取工藝條件優化采用單因素分析、正交試驗、驗證性試驗進行。單因素分析試驗選取提取時間（1.0，1.5，2.0，2.5，3 h；pH值=8；60 ℃；重復3次）、提取溫度（40，50，60，70，80 ℃；pH值=8；2.0 h；重復3次）、pH值（pH值為7.5，8，8.5，9，9.5；70 ℃；2.0 h；重復3次）、料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶40；60 ℃；pH值=9；重復3次）4個因素，探究其對繡球菌多糖提取率的影響。在單因素分析的基礎上，選擇對多糖提取率影響顯著的因素：提取溫度（40，50，60 ℃）、pH值（pH值為7，8，9）、提取時間（2.0，2.5，3 h）、料液比（1∶20，1∶25，1∶30）4因素3水平作為研究對象，設計L9（34）正交試驗（表1），探究對多糖提取率的影響。采用正交試驗所確定的提取條件進行繡球菌多糖的提取，并計算多糖提取率并進行比較。

1.4.6 繡球菌多糖抗氧化活性的研究 繡球菌多糖抗氧化活性的研究分別采用羥基自由基清除試驗—Smirnoff法[10]、超氧陰離子自由基清除試驗—鄰苯三酚自氧化法[10]。清除率：（A0-A）/A0×100% ，式中：A0-對照液的吸光值，A-加入多糖溶液的吸光值。

2 結果與分析

2.1 蛋白質含量

根據考馬斯亮藍法測得蛋白質的標準方程為y=5.6×10-2x-1.31×10-2 （r=0.997 8）。

標準曲線見圖1。經過測定繡球菌多糖中蛋白質含量為10.2%。

2.2 多糖含量

根據酚硫酸法測定的葡聚糖標準方程為：y=9.4 ×10-3x-1.9×10-2 （r=0.997 5）。標準曲線見圖2。經過測定繡球菌多糖含量為43.8%。

2.3 單因素分析試驗結果

2.3.1 提取溫度對繡球菌多糖提取率的影響 測得的多糖提取結果如圖3所示。多糖在50～60 ℃提取率高，而后隨著溫度的升高而逐漸下降；一定范圍內的溫度升高有利于多糖的提取，當溫度過高超出一定范圍時，多糖中結合蛋白變性沉淀可能導致多糖提取率下降。

2.3.2 pH值對多糖提取率的影響 測得的多糖提取結果如圖4所示。隨著pH值的增大，多糖的提取率增加；但當超過最適值8時，多糖的提取率下降，這可能是由于堿性過大導致多糖結構和部分蛋白質變性沉淀，造成提取率下降。

2.3.3 提取時間對多糖提取率的影響 測得的多糖提取結果如圖5所示。隨著提取時間的增加，多糖的提取率明顯增加，而后逐漸趨于平緩，當時間達到2.5 h后，多糖幾乎達到最大限度的溶出率，提取率不再增加。

2.3.4 料液比對多糖提取率的影響 測得的多糖提取結果如圖6所示。隨著料液比的增加，多糖的提取率不斷增大，在料液比較低時，提取液的濃度較大，多糖的溶出率較低，不利于提取。當料液比增加到1∶20時，溶液濃度適中，多糖的溶出率較高，以后提取率逐漸趨于平穩。

2.4 正交試驗結果

通過L9（34）正交試驗，獲得最佳優化條件，結果見表2、表3。

從表2可以看出，極差越大對多糖的提取率影響越大，由大到小的順序依次為D>C>A>B，即提取溫度>pH值>提取時間>料液比。從表3可知，4個因素對提取率的影響都沒有達到顯著水平，因此，繡球菌多糖的最佳提取條件為A1B3C3D3，提取溫度60 ℃、提取時間2 h、pH值9、料液比1∶30。

2.5 驗證性試驗結果

通過驗證性試驗，在提取溫度60 ℃、提取時間2 h、pH值為9、料液比1∶30的條件下，繡球菌多糖的提取率為1.74%。高于其它正交提取條件，說明正交試驗結果有效。

2.6 多糖抗氧化活性的研究結果

2.6.1 多糖對羥基自由基清除率的影響 根據羥基自由基清除試驗，多糖對羥基自由基的清除率結果見圖7。多糖對羥自由基的清除作用隨多糖濃度增大而增大，但當多糖濃度繼續增大，其對羥自由基的清除效果趨于平緩，達到最大值。測得多糖在0.06 mg·mL-1時抗氧化能力達到最大，清除率為10.53%。

2.6.2 多糖對超氧陰離子自由基清除率的影響 根據超氧陰離子自由基清除試驗，多糖對羥基自由基的清除率結果見圖8。隨著多糖濃度的升高，對·OH自由基的清除作用也逐漸加強，且呈現量效關系，之后緩慢下降。繡球菌多糖在0.08 mg·mL-1抗氧化能力達到最大，清除率為21.5%。

3 結論與討論

微堿法提取繡球菌多糖的最佳提取工藝為提取溫度60 ℃、提取時間2 h、pH值9、料液比1∶30，此條件下提取率為1.7%。多糖在0.06 mg·mL-1時對羥自由基清除率達到最大為10.5%，在0.08 mg·mL-1時對超氧陰離子自由基清除率達到最大為21.5%；多糖中蛋白的含量為10.2%，糖含量為43.8%。因此，繡球菌可以作為一種新的具有抗氧化能力的藥用真菌。

本試驗中提取的多糖為堿溶性多糖，堿液的濃度會對多糖的理化性質造成影響，若要更加全面地了解繡球菌多糖的抗氧化活性，還應采用其他提取方法進行對比試驗，同時對提取方法還應進一步完善和改進，以增加提取效率，為繡球菌資源的有效開發利用提供可靠依據。

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