小反芻獸疫研究進展

摘要：小反芻獸疫（Peste des pefits nuninants，PPR）是OIE規定的A類烈性傳染病，我國規定為一類動物疫病，是一種嚴重的烈性、接觸性傳染病，主要感染小反芻獸，特別是山羊高度易感，別的野生動物也可發生。近年來該病呈蔓延的趨勢，2007年7月25日西藏自治區日土縣暴發了我國首例小反芻獸疫疫情，中國動物衛生與流行病學中心確診了這一疫病。該病作為一種重大的跨國動物疫病，嚴重的威脅我國的動物衛生安全，對該病開展研究具有重要的現實意義。就該病的病原學、流行病學、診斷、預防及控制等研究進展進行了綜述。

關鍵詞：小反芻獸疫；小反芻獸疫病毒；病原學；流行病學；臨床癥狀；診斷；預防；控制

中圖分類號：S854 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）01-0074-04

小反芻獸疫又稱小反芻獸假性牛瘟、肺腸炎、口炎肺腸炎綜合征等，是由副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbolivirus）的小反芻獸疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus， PPRV）引起的，主要感染小反芻獸，特別是山羊和綿羊高度易感，野生動物也偶然發生，是一種嚴重的烈性、接觸性傳染病，目前無感染人的報道。該病發病率和死亡率分別高達100%和50%，世界糧農組織（FAO）和世界動物衛生組織（OIE）規定小反芻獸疫為A類傳染病，我國規定為Ⅰ類動物疫病[1]。該病流行于非洲的赤道到撒哈拉地區、大部分中東國家和印度、尼泊爾等與我國接壤的南亞國家，近年來呈蔓延的趨勢[2]。

PPRV于1942年在西非科特迪瓦首次發現，隨后非洲的一些國家相繼發生如尼日利亞、塞內加爾等。近年來，小反芻獸疫（PPR）呈擴散的趨勢，成為重要的跨國動物傳染病之一，并且我國周邊國家頻繁暴發該病， 2007年7月，我國西藏自治區阿里地區日土縣發生小反芻獸疫疫情，死亡262只山羊和綿羊[3]。隨后那曲地區也暴發小反芻獸疫，國家有關部門遵循《中華人民共和國動物防疫法》、《國家突發重大動物疫情應急預案》和《重大動物疫情應急條例》等國家控制重大動物傳染病的相關法律法規進行及時檢測、疫情報告、撲滅等綜合控制措施。這是我國首次發生小反芻獸疫，作為一種重大的動物疫病，小反芻獸疫嚴重威脅著我國的動物衛生安全和我國畜牧業的發展，是需要采取嚴厲的強制預防控制和撲滅的動物疫病之一。該病對我國的動物衛生健康已產生嚴重的威脅，因此在我國PPR還沒有開始大規模流行時，對該病展開研究就顯得十分重要。

1 病毒學

1.1 病毒的形態特征

小反芻獸疫病毒（PPRV）與牛瘟病毒（RPV）、犬瘟熱病毒（CDV）、海豹瘟病毒（PDV）、海豚瘟病毒（DDV）、牛麻疹病毒（MV-K1）和人麻疹病毒（MV）等同屬于副粘病毒科（Paramyxoviriade）的麻疹病毒屬（Morbollivirus）成員，PPRV病毒粒子多呈圓形或橢圓形，直徑約為130～390 nm。病毒顆粒的外有囊膜，囊膜上有纖突，病毒的纖突中只有血凝素（H）蛋白，而沒有神經氨酸酶。

1.2 病毒理化特征

PPRV病毒粒子對外界環境敏感，37℃條件下，PPRV感染力的半衰期為1～3 h。病毒粒子在pH 5.8～11.0時穩定，對酒精、乙醚、甘油和一些去垢劑敏感，大多數的化學滅活劑如酚類、2%的NaOH等作用24 h可以滅活該病毒。使用非離子去垢劑可使病毒的纖突脫落，降低感染力。

1.3 PPRV分子生物學特性

PPRV病毒粒子雖然含有血凝素蛋白，但是不能對猴、牛、綿羊、山羊、馬、豬、犬、豚鼠等大多數哺乳動物和禽的紅細胞具有凝集性。也有研究表明，PPRV抗體可以抑制麻疹病毒對猴紅細胞的凝集作用。

PPRV基因組由單股負鏈無節段RNA組成，RNA鏈從3’至5’依次分布著N-P-M-F-H-L 6個基因，編碼相應的6種主要結構蛋白分別編碼核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、囊膜基質蛋白（M）、纖突糖蛋白（F）、血凝素（H）和大蛋白（L ）6種結構蛋白，此外，P基因還編碼C和V 2種非結構蛋白[4]。N蛋白由N基因編碼，包含一個開放的閱讀框架（ORF），編碼525個氨基酸殘基，N蛋白含有位點，能夠誘導產生受I型MHC分子限制的CTL反應。P蛋白在RNA聚合酶復合物中作為輔助因子與L蛋白相結合，使L蛋白很好地折疊。P 蛋白和核衣殼蛋白結合可維持后者在細胞質中的可溶狀態中，從而阻止其不正常裝配或與非特異RNA結合。P蛋白最不保守。M 蛋白形成病毒囊膜的內層，在成熟病毒粒子從細胞內釋放的過程中，M 蛋白發揮了決定性的作用。當M蛋白缺損時，病毒不能持久穩定的發揮感染細胞的功能。F蛋白是一種融合蛋白，含546個氨基酸，參與病毒介導的溶血、細胞融合和感染的開始。H 蛋白構成病毒的另一種纖突，同時具有血凝素和神經氨酸酶活性，它具有較高的變異性，含有T細胞抗原決定簇。

2 流行病學

2.1 易感動物

該病自然發病主要見于綿羊和山羊，但山羊發病較嚴重，引起體重下降，同時有品種間發病傾向性。綿羊偶有嚴重病例，黃牛、豬與發病的山羊同居不感染。

2.2 地理分布

根據OIE和FAO（1999）的公報，在位于大西洋和紅海之間的大多數非洲國家證實已經感染PPR，感染的地區向北擴展到埃及，向南擴展到肯尼亞，向東擴展到加蓬。近年，PPR傳播到在近東地區和阿拉伯半島，包括伊朗、伊拉克、以色列等10個國家和地區。現在，與我國接壤的南亞地區：印度、尼泊爾、孟加拉國、巴基斯擔和阿富汗也暴發了PPR。

2.3 傳播途徑

該病在易感動物之間可以通過直接接觸的傳播或間接的傳播；容易在多雨的季節和干燥寒冷的季節多發。

3 發病機理

PPRV和其他麻疹病毒屬的致病性相似，具有趨淋巴和趨上皮性。因此，它在動物體的淋巴組織和上皮組織中最容易復制，對這些組織的傷害也最為嚴重，呼吸道可能是病毒進入機體的門戶，病毒通過呼吸道進入機體后，首先在咽喉、下頜淋巴結以及扁桃體復制，2～3 d形成病毒血癥，隨后的2～3 d首次出現臨床癥狀。病毒血癥導致病毒到達全身的淋巴器官脾臟、骨髓和胃腸道及呼吸系統的黏膜繼續增殖[5]。

4 臨床癥狀和病理變化

4.1 臨床癥狀

根據臨床癥狀PPR分為3個型：最急性型、急性型和溫和型[6]。

4.1.1 最急性型 多見于幼齡羊，潛伏期僅有2 d，表現為體溫升高（41～43 ℃），很快表現精神沉郁、被毛逆立、食飲欲減退或廢絕，口腔和眼睛流出黏液性分泌物。疾病第一天可見便秘，緊接著非常快地出現水樣腹瀉，整個病程自出現體溫升高到死亡不超過5～6 d，最急性型沒有明顯的臨床癥狀，死亡率可達100%。

4.1.2 急性型 與牛瘟具有相似的臨床癥狀，潛伏期3～4 d。初期，與最急性型表現相似，缺乏明顯癥狀。表現為發熱急，高達41℃ 以上，可持續3～5 d，發熱1～2 d后，患病動物精神沉郁、食飲欲減退或廢絕、鼻鏡干燥，嘴和眼黏膜潮紅，嘴唇、面頰內面和舌面上部因黏膜壞死而出現針尖大小的灰色區域，呈彌漫性分布。繼而眼睛、鼻子和口腔分泌大量黏液并逐漸變成黃色膿性黏稠狀。分泌物使上腭和眼下被毛潮濕，干燥后使眼瞼黏連，堵塞鼻孔，導致呼吸困難，可出現眼炎，有的甚至失明。后期出現口腔黏膜充血、潰瘍，覆蓋白色的壞死組織被死亡的細胞覆蓋，以至口腔黏膜完全被厚的干酪樣物質附著。用手指在牙床和上腭輕輕摩擦，可采到含有病理組織碎片的有惡臭氣味的物質。發病后期常出現出血性腹瀉，開始時糞便變軟，然后水便，有時含有內臟組織壞死碎片和血液。隨之動物脫水、衰弱、呼吸困難、鼻孔開張，舌伸出，體溫下降，眼球凹陷，常在發病后5～10 d脫水而死，咳嗽、胸部羅啰以及腹式呼吸也常發生，表現出肺炎癥狀[7]。一個常見的特點是，疾病的晚期在鼻、口周圍有小結節形成，但確切的原因還不清楚 。

4.1.3 溫和型 不表現明顯的臨床癥狀，輕微短暫的發熱，有時可見眼睛和鼻腔流出大量的分泌物，并在鼻孔周圍結痂。

4.2 病理變化

病變與牛瘟相似，眼部可見結膜炎，彌散性卡他性炎癥。腸炎，胃腸道大面積壞死，糜爛性損傷從嘴延伸到瘤胃、網胃交接處；皺胃呈有規則、有輪廓的糜爛，刨面紅色出血；小腸一般有中度損傷，呈現有限的出血性條紋；大腸、盲腸、結腸有小的紅色出血點，時間稍長匯合在一起，呈現“斑馬紋”樣特征性線狀條紋。支氣管和肺臟出現干酪樣病灶，肺臟表面、支氣管黏膜等有出血點。所有上皮組織的多核巨細胞（合胞體）和淋巴結一樣能夠觀察到感染，脾臟、扁桃體和淋巴結可見核固縮和核破裂導致淋巴細胞壞死。在舌唇和軟腭出現包涵體，在肺炎肺泡腔出現合胞體細胞，支氣管上皮細胞內出現胞漿包涵體，PPRV對淋巴細胞和上皮細胞有特殊的親和性，一般能在上皮細胞和多核巨細胞中形成具有特征性的嗜伊紅胞漿包涵體。淋巴細胞和上皮細胞壞死，具有診斷價值。

5 診斷方法

目前，已經研究出許多檢測方法針對PPRV感染的診斷。這些方法包括瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID）、免疫熒光抗體試驗（IFAT）和病毒中和實驗（VN）等。隨著免疫學和分子生物學的發展，已經研制出許多種酶聯免疫吸附試驗和分子生物學檢測方法，也是近幾年國外應用的主要檢測方法，其中C-ELISA和PCR方法已經成為OIE規定的檢測標準方法。

5.1 初步診斷

根據動物發病的流行病學特點、病畜的臨床癥狀以及病理解剖變化等特點可以進行初步診斷。但是必須注意牛瘟（RP）、口蹄疫（FMD）、藍舌病（BT）、山羊傳染性胸膜肺炎、巴氏桿菌性肺炎等疾病的鑒別診斷。

5.2 實驗室診斷

5.2.1 樣品采集 實驗室樣品可以采集病畜的眼下結膜、鼻腔以及直腸黏膜等部位的分泌物棉拭子，也可采集凝固的血液或加抗凝劑的全血。病畜剖解后可無菌采集有典型病變的組織樣品，如腸系膜或支氣管淋巴結以及肺臟、脾臟、扁桃體等器官組織[8]。

5.2.2 病毒的分離 樣品采集后可以用原代羔羊腎細胞或非洲綠猴腎細胞（Vero）進行分離培養病毒。PPRV產生的CPE要在接種細胞培養后的5～6 d才能夠出現，具體表現為細胞變圓、收縮，形成多核巨細胞體，有的出現核內包涵體，部分細胞形成空泡。由于CPE出現的較慢，需要一定時間，所以一般在細胞培養4～5 d后應進行盲傳繼代。

5.2.3 瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID） 該試驗所用的標準PPR病毒抗原是由腸系膜或支氣管淋巴結、脾臟或肺組織材料加一定的緩沖液配制而成；所用的標準抗血清是以5 mL含有104TCID50/mL的PPRV高免綿羊，每周注射一次，連續注射4周。在最后一次注射后5～7 d時采血，提取血清制備而成的。Obi tu等采用PPRV的細胞適應毒接種兔子制備的抗PPRV高免血清進行AGID試驗，能夠與麻疹病毒屬的其他3種病毒發生交叉反應，但是如果將其進行1︰100稀釋以后，則僅和其同源的PPRV呈陽性反應。這是一種相對簡單、快速和廉價的檢測方法。但是它的敏感性較低，不能檢測微量抗原，因此也就不能對疾病作出早期診斷[9]。

5.2.4 間接免疫熒光抗體試驗（IFAT） 據報道，應用PPRV的特異性單克隆抗體建立了間接熒光抗體檢測方法，能夠檢測出PPR感染發病的早期和后期病料中的病毒抗原，并且這種方法能夠快速對PPR和RP進行鑒別診斷。

5.2.5 病毒中和試驗（VN） VN具有很強的特異性。可以鑒別PPRV和RPV，也可以鑒別PPRV的不同毒株之間的差異。但是VN也存在明顯的不足：耗費時間較長，一般需要10～12 d才能得到結果；需要細胞培養病毒及無菌的試驗樣品；浪費人力，很難實現大規模樣品的監測。因此這種方法在野外條件下，尤其在發展中國家使用起來十分的不便。

5.2.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 應用ELISA方法監測血清的方法已經十分的成熟，而且有多種試驗方法。間接ELISA方法就是將抗原吸附在酶標板上，然后加入PPRV的病毒特異性血清孵育，最后加入酶結合物和底物監測血清中的特異性抗體。這種方法容易受到待檢材料中的其他蛋白的干擾。針對這一問題，應用免疫捕獲ELISA（夾心ELISA）方法可以更為精確的檢測，即將待檢樣品首先和特異性抗體反應形成免疫復合物，這種復合物隨后被預先包被在酶標板上的二抗（捕獲抗體）所結合，再按常規的方法加酶結合物和底物等進

行[10]。

6 國內外研究進展

6.1 國內研究發展現狀

我國對小反芻獸疫病的研究還處于起步階段。最近幾年，隨著SARS、禽流感等幾次大規模國際性人畜傳染病的暴發，PPR在我國周邊地區的蔓延引起了國內的重視。近年來，中國檢疫檢驗科學研究院、云南出人境檢驗檢疫局、中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所、中國動物衛生與流行病學中心等單位開展了相關的研究，主要是以檢驗檢疫技術為主，建立了RT-PCR檢測小反芻獸疫病毒核酸的方法和進行N、H 基因的克隆和原核以及真核表達。其后又在此基礎上引入了巢式PCR技術，在第一次PCR產物的基礎上進行二次PCR，提高了反應的特異性。

6.2 國際研究發展現狀

最近幾年國際上在小反芻獸疫方面的研究取得了長足發展，以英國動物健康研究所、印度新德里和班加羅爾的幾個研究所為代表的研究機構，先后發表了數十篇相關論文。英國科學家Bailey等公布了第一個小反芻獸疫病毒的全基因序列，并發現PPRV在核酸水平上與RPV非常相似，但在多肽結構上卻更接近于DMV，這為構建感染性克隆、基因功能組學、PCR引物設計，病理學研究奠定了基礎。韓國科學家于2005年，利用單克隆抗體和缺失變異株對PPRV核衣殼蛋白（N 蛋白）的抗原表位進行了分析，最終確定4個抗原性區域（A—I，A一Ⅱ，C-I，C-II）。有學者研究發現Marmo-set B95a細胞可以替代Vero細胞來增殖PPRV。Marmoset B95a是一種E-B病毒改造的狨猴B淋巴細胞的衍生細胞系，它比一般所用的Vero細胞更利于麻疹病毒屬的繁殖與分離，這對于PPRV 的研究是一件非常有用的工具。

7 PPR的控制與預防

控制小反芻獸疫在我國的傳播應從傳染源、傳播途徑及易感動物三個方面入手。目前傳染源主要是在國外和我國的西藏地區，因此當前控制小反芻獸疫在我國大范圍內暴發是首要的任務。在疫區周圍設立警示標志，在出入疫區的交通路口設置動物檢疫消毒站，對出入的人員和車輛進行消毒；必要時，可設立臨時監督檢查站，執行監督檢查任務。動物檢疫消毒站和臨時監督檢查站應按照國家有關規定規范設置。

目前，世界各國對PPR的治療仍無有效的方法，對于已經發病的動物可以采用土霉素、四環素等抗生素以及磺胺類藥物進行輔助治療，以防止細菌等微生物的繼發感染。對于發病的疫區，再用高免血清進行緊急被動免疫以減少疾病的傳播。對于從未發生過PPR的國家和地區，應立即采取封鎖隔離措施，快速建立疫區隔離帶，撲殺已感染的動物，再進行徹底消毒處理。防制PPR的主要措施就是進行疫苗免疫接種。由于PPRV和RPV之間的抗原相關性很強，可用RP組織培養的疫苗對綿羊、山羊進行免疫，產生的抗RP抗體能夠很好的抵抗PPR野毒株的攻擊，但是這種方法不利于全球牛瘟消滅計劃的實施。

因此，有研究人員利用基因反向遺傳技術成功研究出PPRV/RPV的嵌合體疫苗，即利用PPRV的糖蛋白基因取代RPV表面的相應糖蛋白基因。這種方法構建的疫苗，對PPRV能夠產生良好的免疫原性，而且用ELISA方法不能檢出免疫血清中RPV非抗體，也有助于對這兩種疾病進行血清學監控。由于我國已經發生PPR疫情，必須做好邊界接壤地區的動物檢疫，各口岸對進境的動物也要嚴格檢疫，發現感染動物必須立即隔離撲殺、焚燒尸體，進行徹底消毒處理。縱觀國內外研究現狀，對于小反芻獸疫經典的常規診斷方法已經十分成熟，目前常用的ELISA方法和分子生物學的診斷方法也已經建立，并且都已成功開發了相關的試劑盒。涉及到病原微生物方面的相關研究比較困難，且需要在P3級以上的生物安全實驗室才可以進行。因此建立一個方便、快速、安全、敏感、特異的檢測方法對于該病的研究和預防控制具有極其重要的意義。

8 當前存在的問題及展望

長期以來，人們一直認為PPRV是RPV的變異毒株，只是喪失了對牛的致病力，而僅對小反芻獸有致病作用，加上RP和PPR能夠產生交叉免疫保護，可以用RP疫苗預防PPR。因此，在很多國家和地區忽略了對PPR的研究，特別是忽視了PPRV的生物學特性、分子生物學等方面的研究。印度就曾發生過因牛接種RP活疫苗導致羊暴發小反芻獸疫的疫情。用高免血清進行被動免疫在疫病發生時可減少疫病的傳播，但是對已發病的病畜無作用。因此，當前必須積極加強對PPRV的基礎研究，尤其是基因組變異特性的研究，同時加強對該病的流行病學檢測，進一步明晰致病機理，建立高效、快速的病原檢測新方法以及防治等研究，特別是要加強對PPR的免疫機理研究和加強PPR疫苗研究工作，例如高效疫苗株篩選、基因重組疫苗等，早日開發出有效的疫苗，為有效防控乃至最終消滅小反芻獸疫奠定理論基礎。

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