吡格列酮對家兔局灶性腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響

[摘要] 目的 探討吡格列酮對腦缺血再灌注損傷家兔細(xì)胞凋亡的影響及其機制。 方法 40只雄性家兔隨機分為5組：①假手術(shù)組（S組，n = 8）；②模型組（M組，n = 8）；③吡格列酮組（P組，n = 8）；④GW9662+吡格列酮組（GP組，n = 8）；⑤DMSO組（D組，n = 8）。除S組外，其余各組均通過線栓法建立家兔大腦中動脈阻塞（MCAO）再灌注損傷模型。于術(shù)前30 min分別給予相應(yīng)處理。缺血120 min再灌注24 h后，對家兔進(jìn)行神經(jīng)功能評分；HE染色觀察病理形態(tài)學(xué)，TUNEL檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 結(jié)果 ①與S組比較，M組神經(jīng)功能評分明顯增加（P < 0.05）；與M組比較，P組神經(jīng)功能評分明顯降低（P < 0.05）。②與S組比較，M組凋亡細(xì)胞明顯增加（P < 0.05）；與M組比較，P組凋亡細(xì)胞明顯降低（P < 0.05）。 結(jié)論 吡格列酮可通過減輕形態(tài)學(xué)改變、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 吡格列酮；GW9662；腦缺血/再灌注；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R743.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）04-0001-03

近年研究表明，PPARγ表達(dá)的升高對于腦缺血再灌注損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[1]，已成為腦血管病研究領(lǐng)域中的熱點課題。作為PPARγ的激活配體——吡格列酮（pioglitazone，PGZ）臨床上廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病，但有研究表明其對腦缺血再灌注損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[2]，而具體機制尚未完全闡明。本實驗采用家兔局灶性腦缺血再灌注模型，應(yīng)用PGZ進(jìn)行預(yù)處理，觀察其對家兔術(shù)后神經(jīng)功能及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組

清潔級雄性家兔40只，重量750～1 000 g。術(shù)前12 h禁食不禁水，隨機分為5組，每組8只：①假手術(shù)組（S組）；②模型組（M組）；③吡格列酮組（P組）；④GW9662+吡格列酮組（GP組）；⑤DMSO組（D組）。

1.2 試劑

吡格列酮、GW9662和10%二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司，美國）；原位末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（Promega公司）；電子顯微鏡（Olympus，日本）等。

1.3 動物模型制備及處置

M組：術(shù)前20 min經(jīng)耳緣靜脈注射生理鹽水2 mL/kg，采用改良的Zea-longa[3]法制備家兔大腦中動脈阻斷（MCAO）模型。缺血120 min后抽出線栓即可造成再灌注模型。模型成功標(biāo)志：蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner綜合征；爬行時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或跌倒。P組：術(shù)前20 min經(jīng)耳緣靜脈注射吡格列酮10 mg/kg。GP組：術(shù)前20 min先經(jīng)耳緣靜脈注射GW9662，劑量是0.3 mg/kg[4]，5 min后再經(jīng)耳緣靜脈注射吡格列酮10 mg/kg。D組：術(shù)前20 min經(jīng)耳緣靜脈注射10% DMSO 2 mL/kg。S組：術(shù)中分離左側(cè)CCA、ICA及ECA，但不做任何缺血處理。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 神經(jīng)功能評分 再灌注24 h后采用雙盲法按Zea-longa 5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，標(biāo)準(zhǔn)如下：①無神經(jīng)功能缺失癥狀，計0分；②不能伸展右側(cè)前肢，計1分；③爬行時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，計2分；④身體向右側(cè)傾倒，計3分；⑤不能自發(fā)爬行、意識障礙，計4分。

1.4.2 HE染色 將各組8只家兔麻醉，以生理鹽水進(jìn)行心臟灌洗，用4℃ 10%多聚甲醛灌洗固定，并迅速斷頭取腦。距額葉前端3 mm和9 mm處進(jìn)行冠狀分離，取中間6 mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫兩側(cè)約2 mm處，從上至下切去兩側(cè)半球的正中結(jié)構(gòu)，將左側(cè)腦塊作為缺血腦組織，制成蠟塊。自前往后連續(xù)冠狀位切片，厚約5 μm。HE染色光學(xué)顯微鏡下（400×）觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并采圖。

1.4.3 TUNEL染色 嚴(yán)格按照試劑盒檢測步驟進(jìn)行操作。TUNEL染色在光鏡下（400×）觀察凋亡細(xì)胞（以胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表），計算TUNEL陽性率即TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值并采圖。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。神經(jīng)功能評分中位數(shù)/四分位數(shù)法表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及神經(jīng)功能改變

S組家兔對外界反應(yīng)靈敏，其余4組家兔對外界反應(yīng)靈敏度不同程度降低，其中以M組最遲鈍，P組最佳。5組家兔神經(jīng)功能評分比較見表1。

2.2 HE染色的比較

切片經(jīng)HE染色后，光鏡下可見S組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)色淡且均勻，核大而圓，核仁明顯（圖1A）。M組呈明顯的缺血損傷性改變，多數(shù)細(xì)胞體積縮小，胞漿疏松，胞核固縮深染，部分細(xì)胞壞死（圖1B）。經(jīng)吡格列酮預(yù)處理的P組缺血性損傷改變較M組明顯減輕，壞死區(qū)域縮小（圖1C），而GP與D組較M組的缺血改變則無明顯減輕，可見神經(jīng)細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死（圖1D和圖1E）。

2.3 TUNEL染色的比較

S組只有少量凋亡細(xì)胞（圖2A），與其余4組大鼠相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。M組凋亡細(xì)胞陽性率為（63.06±9.05%，圖2B），而經(jīng)吡格列酮預(yù)處理的P組相應(yīng)區(qū)域凋亡細(xì)胞陽性率（48.10±7.61%，圖2C），兩組相比差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而GP與D組較M組的細(xì)胞凋亡率則無明顯改變。5組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞率比較見表1。

3 討論

既往研究表明，腦缺血再灌注時神經(jīng)細(xì)胞可介導(dǎo)大量炎性細(xì)胞的聚集和炎性因子的釋放[5]，造成神經(jīng)元凋亡，從而造成對缺血損傷區(qū)域細(xì)胞的損傷。本研究也發(fā)現(xiàn)模型組中細(xì)胞凋亡數(shù)量相比假手術(shù)組顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑能活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶而抑制NF-κB的激活[6]。NF-κB可調(diào)控表達(dá)許多參與炎癥反應(yīng)、氧化損傷、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過程的蛋白基因。持續(xù)活化在垂死神經(jīng)元中的NF-κB可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括重新進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)失敗和生成死亡蛋白[7]；炎癥反應(yīng)過程中釋放一系列細(xì)胞因子信號降解IκB的激酶（IKK）活化并磷酸化IκB的兩個Ser殘基，釋放出與IκB相結(jié)合的NF-κB并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核而使目的基因的表達(dá)增加，從而產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)參與病理生理過程[8，9]。

吡格列酮作為PPARγ特異性激動劑，目前在臨床主要用于治療2型糖尿病。國內(nèi)有研究報道，吡格列酮促進(jìn)PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)，增強其對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，并且與劑量成正比[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)吡格列酮預(yù)處理后的家兔神經(jīng)功能缺損較模型組明顯改善，缺血半暗帶的頂葉皮質(zhì)中細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。由此我們認(rèn)為吡格列酮可通過減少細(xì)胞凋亡而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用；若事先靜脈注射GW9662[11]后再給予吡格列酮，則可逆轉(zhuǎn)吡格列酮的上述保護(hù)作用；同樣，單獨行DMSO預(yù)處理后的大鼠在相關(guān)方面未得到明顯的改善。

除此之外，從腦組織病理形態(tài)學(xué)比較來看，模型組家兔腦組織變性壞死的細(xì)胞明顯高于其余四組且主要分布于缺血半暗帶的頂葉皮質(zhì)，主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞壞死，表明再灌注后缺血半暗帶發(fā)生了明顯的細(xì)胞變性壞死反應(yīng)，符合缺血缺氧性病理變化；而經(jīng)吡格列酮預(yù)處理組家兔腦組織則以神經(jīng)細(xì)胞腫脹為主，表明吡格列酮具有抗細(xì)胞壞死作用，在一定程度上挽救了受損的神經(jīng)細(xì)胞，對缺血再灌注腦損傷起到一定的保護(hù)作用；而預(yù)先給予GW9662后再行吡格列酮預(yù)處理及單獨行DMSO預(yù)處理的家兔腦組織病理形態(tài)學(xué)方面均無明顯改善，提示吡格列酮具有阻止或延緩神經(jīng)細(xì)胞壞死，對保護(hù)缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷具有積極意義，而GW9662則可逆轉(zhuǎn)吡格列酮抗細(xì)胞壞死的效應(yīng)。

由此可見，吡格列酮可通過減輕家兔缺血再灌注后的損傷，從而很好地減少細(xì)胞凋亡，為該藥在缺血性腦血管疾病的臨床使用提供一定的理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Allahtavakoli M，Shabanzadeh A，Roohbakhsh A，et al. Combination theapy of rosiglitazone， a peroxisome proliferators-activated receptor-gamma ligand， and NMDA receptor antagonist （MK-801） on experimental embolic stroke in rats[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol，2007，101（5）：309-314.

[2] Sundararajan S，Gamboa JL，Victor NA，et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-ligands reduce inflammation and infarction size in transient ischemia[J]. Neuroscience，2005，130（3）：685-696.

[3] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20（1）：84-91.

[4] Shimizu T，Szalay L，Hsieh YC，et al. A role of PPARgamma in and rostenediol-mediated salutary effects on cardiac function following trauma-hemorrhage[J]. Ann Surg，2006，244（1）：131-138.

[5] Denes A，Thornton P，Rothwell NJ，et al. Inflammation and brain injury：acute cerebral ischaemia， peripheral and central inflam mation[J]. Brain Behav Immun，2010，24（5）：708-723.

[6] Chen F，Wang M，O，Connor JP，et al. Phosphorylation of PPARgamma via active ERK1/2 leads to its physical association with P65 and inhibition of NF-kappa beta[J]. J Cell Bioehem，2003，90（4）：732-744.

[7] Collion M，Aragno M，Castiglia S，et al. Insulin reduces cerebral isehemia/reperfusion in jury in the hippocampus of diabetic rats： a role for glycogen synthase kinase-3 beta[J]. Diabetes，2009，58（1）：235-242.

[8] Kapadia R，Yi JH，Vemuganti R. Mechanisms of anti-inflammatory and neuroprotective actions of PPAR-gamma agonists[J]. Front Biosci，2008，13：1813-1826.

[9] Culman J，Zhao Y，Gohlke P，et al. PPAR-gamma： therapeutic target for ischemic stroke[J]. Trends Pharmacol Sci，2007，28（5）：244-249.

[10] 劉尊敬，楊期東，劉運海，等. 腦梗死患者周圍血淋巴細(xì)胞PPARγ mRNA動態(tài)變化[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2004，21（6）：521-522.

[11] Kamada N，Calne RY. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage[J]. Transplantation，1979，28（1）：47-50.

（收稿日期：2012-11-05）