手足口病腸道病毒檢測中兩種核酸提取方法的比較

[摘要] 目的 對手工核酸提取法和全自動核酸提取儀法在手足口腸道病毒RNA熒光定量PCR檢測中提取效率、重復性、耗時和成本進行比較。 方法 手工法試劑盒和全自動核酸提取儀對樣本進行核酸提取，采用實時熒光定量PCR進行評價。 結果 提取儀法陽性46例，試劑盒法陽性43例，二者無明顯差異（P > 0.05）。提取儀法重復性高于試劑盒法（CV3.5%<5%）。核酸液終體積：提取儀法70 μL，試劑盒法50 μL。提取儀法耗時較短，成本較高；試劑盒法耗時較長，成本較低。 結論 兩種方法結果無顯著差異，均能滿足臨床需要，核酸提取儀法更具優勢。

[關鍵詞] 手足口??；病毒核酸提取；CT值

[中圖分類號] R450 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）04-0111-02

手足口病是由腸道病毒引起的一種兒童傳染病[1]，其病毒核酸提取多為手工法，操作步驟繁瑣；全自動核酸提取儀極大簡化了操作步驟。本文以手足口病患者為研究對象對這兩種方法進行比較，為合理選擇方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

100份手足口腸道病毒檢測標本均由杭州市第六人民醫院提供，標本類型為糞便。

1.2 試劑及儀器

Viral Nucleic Acid Extraction Kit II 購自Geneaid公司（Geneaid 試劑盒），全自動核酸提取儀NP968購自西安天隆科技有限公司（天隆NP968核酸提取儀），天隆核酸提取試劑盒，上海輝睿生物科技手足口腸道病毒RNA檢測試劑盒熒光PCR法，美國Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System，德國Eppendorf離心機5418R，美國Vortex Genie2旋渦混合器，海門其林貝爾LX-200迷你離心機，吉諾生物1×PBS緩沖液，德國Eppendorf Research plus 移液器，美國Axygen公司實驗室耗材EP管、吸頭、PCR反應管等。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本準備 挑取黃豆大小糞便標本于1.5 mL EP管中，加1 mL PBS緩沖液充分混勻后12 000 rpm離心5 min，取上清液提取核酸。

1.3.2 病毒核酸提取 ①Geneaid 試劑盒根據硅膠膜離心吸附柱純化原理，按照說明書操作，取200 μL上述處理后樣本加細胞裂解液裂解、離心粘柱、洗滌液洗滌、加RNase-free water洗脫等步驟后提取純化核酸50 μL。②天隆NP968 核酸提取儀利用磁珠吸附原理，從病毒樣本中提取手足口病毒RNA。按照說明書操作，試劑配制、加樣（在96孔板的第1及第7排中分別加入30 μL Proteinase K、100 μL樣品及4 μL Acryl Carrier），運行自動化程序（預先根據說明書設定裂解、結合、洗滌、洗脫、棄磁珠的時間和反應體積及溫度），自動化程序結束后，將第6及第12排的洗脫液轉移至干凈EP管中。

1.3.3 熒光PCR法 上海輝睿生物科技手足口腸道病毒RNA檢測試劑盒采用One-Step Real Time PCR及TaqMan熒光探針技術[2]，人腸道病毒基因序列的高度保守區域及CoxA16和EV71基因序列的高度保守區域設計引物及熒光探針，通過全自動熒光PCR儀對疑似腸道病毒感染患者標本中的腸道病毒及CoxA16和EV71 RNA進行擴增檢測，從而實現對腸道病毒及CoxA16和EV71 RNA的定性檢測。根據本試劑盒說明書步驟將兩種不同方法提取的各100份待檢樣本核酸采用熒光PCR法進行檢測。①試劑準備：按樣本數n（樣本數加陰、陽性對照）取CoxA16/EV71/EV-U反應液Ⅰn×7.5 μL、CoxA16/EV71/EV-U 反應液Ⅱn×4 μL、酶混合液 n×5 μL、RNase Free水 n×3.5 μL混于一EP管中，旋渦振蕩器上混勻，按每管20 μL分裝。②加樣：在上述加好試劑的PCR反應管中分別加入陰、陽性對照與待測樣本核酸模板各5 μL，蓋緊管蓋，瞬時低速離心。③PCR擴增檢測：將待檢PCR管按順序置于ABI7500 PCR儀上，設定參數：逆轉錄反應50℃ 30 min，預變性95℃ 5 min，再進入循環（變性95℃ 10 s，退火、延伸及檢測熒光55℃ 45 s），共運行40個循環。④結果判定：根據CT值判定結果：CT值≥38或undet為陰性，CT值<35為陽性，35≤CT值<38為檢測灰區。

1.3.4 提取效果比較 為能夠直觀地比較兩種方法，以100份樣本中的陽性率、陰性率、檢測灰區及CT值，比較兩種方法的提取效果。

1.3.5 重復性比較 取陽性標本中20份CT值較低的樣本用兩種方法再平行重復做2次，計算CT值的平均值，測算兩種提取方法的變異系數。

1.3.6 其他性能考察 對兩種方法的提取方式、操作耗時和成本進行比較分析。

2 結果

2.1 兩種方法提取手足口腸道病毒核酸效果比較

對100份手足口腸道病毒檢測標本使用兩種方法提取RNA ，然后使用一步法實時熒光RT-PCR 進行檢測，定量評價使用循環閾值（CT）。

2.1.1 定性結果 Geneaid 試劑盒核酸提取方法與天隆NP968 核酸提取儀兩種不同提取方法檢測結果見表1。應用統計學χ2檢驗表明：Geneaid 試劑盒法與天隆NP968 核酸提取儀法差異無統計學意義（P > 0.05），即兩種核酸提取方法結果無顯著差異。

表1 兩種不同核酸提取方法的手足口腸道病毒檢測結果

2.1.2 定量結果 Geneaid 試劑盒核酸提取方法（G法）與天隆NP968 核酸提取儀提取方法（T法）都檢測為陽性的43份標本，其中CTG小于CTT有18份，平均差值-1.98；CTG大于CTT有19份，平均差值2.02；CTG等于CTT有6份（P > 0.05），G法與T法定量結果相近，無顯著差異。Geneaid 試劑盒法100份樣本中CT值在檢測灰區的有12份，天隆NP968核酸提取儀法100份樣本中CT值在檢測灰區的只有6份，Geneaid 試劑盒法是手工提取，每一步液體轉移都要用手工完成，較易受污染。

2.2 兩種方法檢測重復性比較

20份陽性標本重復性測試結果見表2。結果顯示：天隆NP968核酸提取儀法重復性較高于Geneaid 試劑盒法（CV3.5%

2.3 試劑盒其他性能參數比較

Geneaid 試劑盒法起始樣本體積200 μL，天隆NP968 核酸提取儀法起始樣本體積100 μL；但核酸提取液終體積不同，Geneaid 試劑盒法50 μL，天隆NP968 核酸提取儀法70 μL，為定量檢測均提供了足夠體積的模板量。在操作耗時方面，Geneaid 試劑盒法為手動提取核酸，步驟較多，提取時間較長，提取20～30份標本需90 min；而天隆NP968 核酸提取儀法是執行自動化程序，操作簡便，（30～60） min/次，每次可同時提取1～32份樣品。檢測成本參考廠家的報價，Geneaid 試劑盒每個樣本使用成本為20元，天隆NP968 核酸提取儀試劑盒為每樣本30元。

3 討論

本次實驗選用的兩種方法的應用原理都是在氧化硅與核酸特異性結合的原理基礎上發展起來的，通過裂解液將細胞裂解，從細胞游離出來的核酸特異地吸附在特定的硅載體上。Geneaid 試劑盒是硅膠膜離心吸附柱法，使核酸吸附留在離心柱的濾膜上，通過洗脫得到純化的核酸。天隆NP968 核酸提取儀是依據磁珠吸附原理，運用納米技術制備成超順磁性氧化硅納米磁珠，能與核酸分子特異高效地結合，利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽和外加磁場的作用下，經洗脫即得到純化的核酸。磁珠法具有良好的重復性和提取效率，對黃疸和溶血有較強抗干擾能力，對擴增試劑的兼容性好，是一種理想的核酸提取方法[3]。

本次研究兩種核酸提取方法結果差異不大，最大的不同是兩者在自動化使用方便程度。天隆NP968 核酸提取儀法效率更高，重復性更好（CV3.5%）。如只考慮成本可首選Geneaid 試劑盒法，但由于Geneaid 試劑盒法需要多次離心和液體轉移，每一步都要用手工完成， 操作步驟繁瑣，提取時間較長，對環境的要求和實驗人員的要求高，不適合大量樣本篩查工作，特別是以后集中化檢測。天隆NP968 核酸提取儀法操作簡單，提取時間短，需要的標本量少，提取效率高，提取的核酸純度高，檢測重復性好。提取過程減少了人工操作，能避免人工操作引起的差異及錯誤，其具有內置可定時紫外消毒功能，可嚴格控制孔間污染及批次間污染，杜絕交叉污染；封閉提取倉減少了操作者與試劑的接觸，避免有害物質對人體的危害，適合大量標本檢測，更能較好地適應大規模集中化檢測。

手足口病目前除了細胞培養以外常用的檢測方法為熒光RT-PCR法，該方法靈敏度、特異性均較高[4]。隨著病毒核酸檢測需要的日益增加，市場上可供使用的核酸提取試劑盒逐漸增多，不同核酸提取方法對病毒核酸的提取，可影響RT-PCR 的檢測效果[5]；各實驗室應根據自身條件、樣本的實際情況和使用目的，綜合考慮操作繁瑣程度、實驗耗時、檢測成本等多方面的因素來合理選擇。

[參考文獻]

[1] 張國梁，李澤庚，尚麗莉，等. 手足口流行病學文獻分析的初步探討[J]. 中醫藥臨床雜志， 2010，22（7）：565-567.

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[3] 李德成，黃曉佳，陳雄毅，等.不同核酸提取方法在HBV DNA熒光定量檢測中的比較[J]. 國際檢驗醫學雜志，2010，31（12）：1361-1363.

[4] 閻巖，王定明，胡靜，等. 三種分子生物學方法診斷手足口病的比較[J]. 貴州醫藥，2011，35（2）：107-109.

[5] 王聰，陳之遙，武海萍，等. 三種核酸共提取試劑盒對血液病毒提取效能的比較研究[J]. 臨床誤診誤治，2011，24（8）：6-9.

（收稿日期：2012-11-29）