益母草堿對阿霉素致斑馬魚心臟毒性保護(hù)作用的初步研究

[摘要] 目的 觀察不同濃度的鹽酸益母草堿對阿霉素所致斑馬魚胚胎心臟毒性的保護(hù)作用。 方法 應(yīng)用發(fā)育正常受精后48 h的斑馬魚胚胎作為實(shí)驗?zāi)Ｐ停名}酸益母草堿+阿霉素（濃度為0+30 mg/L，30 mg/L+30 mg/L，60 mg/L+30 mg/L，120 mg/L+30 mg/L）處理上述胚胎，分別于受精后60 h、72 h和96 h時觀察胚胎心臟的形態(tài)及心率的變化。 結(jié)果 各給藥組以及對照組在給藥后均出現(xiàn)心率減慢、心臟區(qū)域出血的胚胎心臟中毒現(xiàn)象。但益母草堿聯(lián)合用藥組的心臟毒性作用較小，且隨著鹽酸益母草堿濃度的升高，阿霉素的心臟毒性作用明顯減小。 結(jié)論 阿霉素對斑馬魚胚胎具有心臟毒性作用，而鹽酸益母草堿對阿霉素所致心臟毒性具有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 鹽酸益母草堿；阿霉素；斑馬魚；心臟毒性

[中圖分類號] R99 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）04-0010-02

斑馬魚（zebrafish）是新近興起的一種理想的模式生物，與其他模式生物相比，它的胚胎透明而且是體外發(fā)育，繁殖快，很容易觀察藥物及基因干預(yù)后對活體器官，具有基因敲除小鼠等大模式動物不具備的很多優(yōu)點(diǎn)[1]。抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也導(dǎo)致人體正常組織、器官的損傷，特別是對心臟的毒性反應(yīng)。心率是體現(xiàn)心臟功能的一個重要指標(biāo)，對心率的記錄可以比較直觀反應(yīng)某一藥物的心臟毒性[2]。本實(shí)驗利用新型模式生物斑馬魚，通過阿霉素構(gòu)建心臟毒性模型，觀察鹽酸益母草堿對斑馬魚阿霉素心臟毒性的保護(hù)作用，為臨床心臟毒性抗腫瘤藥物的安全使用以及心臟毒性作用的降低提供初步研究資料。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗動物

野生型斑馬魚（AB系）來自于華中科技大學(xué)，養(yǎng)殖系統(tǒng)從美國AquaticHabitats公司引進(jìn)。養(yǎng)殖根據(jù)zebrafish book中描述的方法進(jìn)行，交配前雌雄分開飼育，照明/黑暗14 h/10 h交替，定時喂料，獲取胚胎時，將5條雌魚15條雄魚（雌∶雄=1∶3）混合，收集的胚胎培養(yǎng)于28.5℃隔水式培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)大約 20 h（21個體節(jié)階段）后顯微鏡下挑出健康的胚胎，按形態(tài)特征區(qū)分發(fā)育階段，及時挑出死亡胚胎和幼魚，超過24 h的胚胎經(jīng)0. 003 g/L苯硫脲（PTU）處理防止黑色素的形成，以方便觀測。受精卵按照Westerfield描述對發(fā)育階段分期[3]。

1.2 儀器及試劑

阿霉素（Adriamycin，ADR，購于上海阿拉丁試劑有限公司，純度>98%），鹽酸益母草堿（Leonurine hydrochloride，LH，購于武漢福鑫化工有限公司，純度>98%），斑馬魚胚胎培養(yǎng)液（參照Zebrafish book標(biāo)準(zhǔn)，0.137 mol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.25 mmol/L Na2HPO4，1.3 mmol/L K2HPO4，1.3 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，4.2 mmol/L NaHCO3），PBS緩沖液，體視顯微鏡（上海長方化學(xué)儀器有限公司，XTZ-D型）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制 阿霉素以及鹽酸益母草堿用二甲基亞砜（DMSO）助溶，將其配成貯存液，避光置于-20℃冰箱，實(shí)驗時再以胚胎培養(yǎng)液稀釋到所需濃度（實(shí)驗組藥物濃度：鹽酸益母草堿+阿霉素=0+30 mg/L，30 mg/L+30 mg/L，60 mg/L+30 mg/L，120 mg/L+30 mg/L）。另設(shè)空白組（含0.1%DMSO的胚胎培養(yǎng)用水，不加阿霉素）以及對照組（含0.1%DMSO的胚胎培養(yǎng)用水，30 mg/L阿霉素，不加鹽酸益母草堿）。

1.3.2 胚胎處理方法 根據(jù)預(yù)實(shí)驗設(shè)定阿霉素濃度為30 mg/L，96孔板的樣孔中預(yù)先加入各實(shí)驗組溶液。再挑選發(fā)育48 h胚胎為模型，隨機(jī)放入樣孔中，每個實(shí)驗組20個胚胎。隨后于光照培養(yǎng)箱中恒溫（28.5℃）孵育，并分別于施藥后12 h， 24 h，48 h觀察并記錄各實(shí)驗組胚胎的心臟形態(tài)、循環(huán)系統(tǒng)血流、心率等指標(biāo)。為盡量減少實(shí)驗誤差，以上實(shí)驗重復(fù)3遍，所用胚胎為同一批受精胚胎。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用重復(fù)測量的方差分析，比較斑馬魚個體心率隨時間的變化及各用藥組間的變化，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理，計量資料以（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

體視顯微鏡下觀察，實(shí)驗組和對照組的斑馬魚胚胎，處理12 h、24 h、48 h后，斑馬魚心率較空白組減慢（表1）。但對照組胚胎心臟區(qū)域出現(xiàn)心膜出血癥狀，心跳微弱，血液循環(huán)受阻，血細(xì)胞在心區(qū)堆積（圖1，2，3），隨著時間的延長藥物的作用持續(xù)，到48 h后心臟形態(tài)線性化，心囊水腫，血液循環(huán)停止，心跳微弱以至停止。而實(shí)驗組中胚胎心臟區(qū)域出血癥狀以及心率較對照組有明顯改善，且這種改善與鹽酸益母草堿濃度正相關(guān)。

以空白組為參照，采用重復(fù)測量的方差分析，個體隨時間的變化F = 99.397，P < 0.001，認(rèn)為時間因素對心率變化是存在影響的，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；以對照組為參照，采用重復(fù)測量的方差分析，個體隨時間的變化F = 176.795，P < .001 認(rèn)為時間因素對心率變化是存在影響的，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；時間因素和分組因素：F = 0.437，P = 0.727，認(rèn)為時間因素和分組因素不存在交互作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

阿霉素屬蒽醌類抗腫瘤抗生素，具有抗瘤譜廣、抗瘤作用強(qiáng)等特點(diǎn)，在臨床上廣泛用于治療多種惡性腫瘤，但由于其具有獨(dú)特的心臟毒性，使用受到限制[4]。益母草堿是從中草藥益母草中提取分離的主要有效成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，益母草具有調(diào)經(jīng)止血興奮子宮、減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注所造成的損傷、抗血小板聚集、降低血液黏度、同時可以活化T淋巴細(xì)胞以及增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能等諸多作用[5]。

斑馬魚是研究脊椎動物早期發(fā)育的最重要的模式動物之一，胚胎發(fā)育在體外完成，經(jīng)PTU處理后透明可見其心臟結(jié)構(gòu)僅為一房一室，在形態(tài)上與人類心臟有很大的不同，但斑馬魚心血管發(fā)育異常與人類左心室發(fā)育不全相似，因此利用斑馬魚研究藥物對人類心臟毒性的機(jī)制是可行的[6，7]。斑馬魚早期胚胎透明，發(fā)育24 h時已出現(xiàn)心跳，發(fā)育48 h時已形成功能化的心臟，借助顯微鏡很方便觀察藥物對心臟的毒性作用[8]。更重要的是斑馬魚胚胎在心血管系統(tǒng)循環(huán)缺失的情況下，仍然能通過對氧的被動運(yùn)輸而生存和繼續(xù)發(fā)育一段時間。而在一些利用其他模型生物的研究中，胚胎常因心血管系統(tǒng)發(fā)育嚴(yán)重異常或全身嚴(yán)重畸形而早期死亡，從而終止了對心血管發(fā)育的觀察[9]。

本研究顯示，阿霉素對斑馬魚胚胎發(fā)育具有明顯的心臟毒性作用，且其毒性隨著藥物作用時間的延長而增加，益母草堿對阿霉素引起的斑馬魚胚胎心臟毒性具有保護(hù)作用，且當(dāng)濃度在120 mg/L以下時，隨著益母草堿濃度的升高起保護(hù)作用增強(qiáng)。但益母草堿對阿霉素引起的斑馬魚胚胎心臟毒性的保護(hù)作用的分子機(jī)制以及信號通路有待進(jìn)一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 姜利軍，周曉曦，李欽璐，等. 斑馬魚GiF-1基因結(jié)構(gòu)和功能分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12（17）：3213-3216.

[2] 黃惠琳，劉華鋼，蒙怡，等. 氯化兩面針堿對斑馬魚胚胎心臟影響的初步研究[J]. 廣西醫(yī)學(xué)，2011，33（5）：546-548.

[3] Wasterfield M. The Zebrafish book：A guide for the laboratory use of Zebrafish （danio retio）[M]. 4th ed. Eugene：University of Oregon Press，1993：31-46.

[4] 孫江波，于彩娜，徐丹，等. 中藥人參、附子及其小復(fù)方參附湯抑制阿霉素心臟毒性損傷大鼠細(xì)胞凋亡的研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（4）：754-756.

[5] 阮金蘭，杜俊蓉，曾慶忠，等. 益母草的化學(xué)、藥理和臨床研究進(jìn)展[J].中草藥，2003，34（11）：15-19.

[6] 龔春華，李愛國，趙慶順，等. 視黃酸對乙醇致斑馬魚胚胎心臟發(fā)育畸形的影響[J]. 實(shí)用兒科臨床雜志，2010，25（1）：53-56.

[7] Teresa J Bohlmeyer，Steve Helmke，Shuping Ge，et al. Hypoplastic left heart syndrome myocytes are differentiated but possess a unique phenotype[J]. Cardiovascular Pathology，2003，12（1）： 23-31.

[8] 王思鋒，劉可春，王希敏，等. 雷公藤紅素對斑馬魚胚胎心臟毒性的初步研究[J]. 中國藥理學(xué)通報，2009，25（5）：634-636.

[9] 孫淑娜，桂永浩 蔣繆，等. 葉酸缺乏對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育影響的實(shí)驗研究[J]. 中華兒科雜志，2010，48（12）：905-912.

（收稿日期：2012-10-18）