昆蟲抗菌肽在農業上的應用潛力

摘 要：綜述了昆蟲抗菌肽的分類、抗菌機制和在農業生產中的應用，淺析了昆蟲抗菌肽在農業生產中的優勢和實用發展潛力。

關鍵詞：昆蟲抗菌肽；抗菌機制；農業生產

中圖分類號：Q966 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.03.012

抗菌肽是具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性的小分子肽。昆蟲是世界上物種種群最多的生物，為適應多樣的生活環境，昆蟲自身可形成獨特的免疫系統，并自行分泌抗菌肽。昆蟲抗菌肽是最先被發現的一類抗菌肽，多帶正電荷，水溶性好，熱穩定性強，無免疫原性，對宿主細胞具有選擇殺傷性，均為堿性多肽，N端為多聚腺苷酸殘基，C端均酰胺化，第二位氨基酸多為色氨酸（Try），具兩親性結構，分子量約為4 kDa，可抗革蘭氏陽性菌和陰性菌。

1 昆蟲抗菌肽的分類與結構

昆蟲抗菌肽的分子量一般小于10 kDa，主要從鱗翅目（Lepidoptera）、雙翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）等中分離提取。根據其抗菌譜，昆蟲抗菌肽分為：（1）抗革蘭氏陰性菌，即富含脯氨酸的抗菌肽（Proline-rich Peptides）和少數富含半胱氨酸的抗菌肽（Cysteine-rich Peptides）以及富含甘氨酸的抗菌肽（Glycine-rich Peptides）；（2）抗革蘭氏陽性菌，通常多為富含半胱氨酸的抗菌肽；（3）既抗革蘭氏陽性菌又抗革蘭氏陰性菌的無特殊氨基酸結構的抗菌肽。

無特殊氨基酸結構的抗菌肽，如天蠶素（Cecropins），廣泛存在于家蠶、柞蠶等中。分子內部含有兩性分子的α-螺旋結構，具有保守氨基酸殘基，但不含半胱氨酸和二硫橋。

富含半胱氨酸的抗菌肽，富含半胱氨酸，具有二硫橋，廣泛分布于半翅目、雙翅目等中。如昆蟲防御素（Thanatin）分子內部含有兩性分子的α-螺旋和二硫橋，且二硫橋在抗菌過程中起到關鍵作用。

富含脯氨酸的抗菌肽多在雙翅目、半翅目、鞘翅目、膜翅目等中發現，由約15～34個氨基酸殘基組成，脯氨酸含量占25%以上。如蜜蜂血淋巴中的Aptdaecin，其氨基酸組成成分中，脯氨酸含量高達33%。

富含甘氨酸的抗菌肽多分布于鱗翅目、膜翅目等中，具有O-糖基化。如來自Gloverins家族的抗菌肽，其一級結構富含大量甘氨酸，且位置高度保守，無半胱氨酸，熱穩定性好。

2 抗菌肽的抗菌機制

目前，抗菌肽的作用機制可根據作用對象的類型分為：抗真菌型、抗細菌型和抗病毒型。

2.1 抗真菌活性作用機制

Histatin 5是從人體唾液中提取出的具有抗真菌活性的多肽。Helmerhors等[1]研究發現，Histatin 5為陽離子肽，主要以α-螺旋結構或β-折疊形式存在，具有兩親性。由于堿性抗菌肽所帶的正電荷與線粒體膜上的負電荷通過靜電作用互相吸引，Histatin 5能作為線粒體引導肽的類似物與線粒體膜結合，且不依賴于線粒體膜表面的蛋白，因為堿性抗菌肽和膜負電勢的因素，與線粒體結合造成線粒體膜滲透勢改變，線粒體破裂，真菌死亡。

2.2 抗細菌活性作用機制

肽分子并不是插入膜內，而是與質膜外小葉表面的局部連接?？咕目赏ㄟ^氨基降低菌體膜的通透性和膜電勢差，進而導致細胞內容物的泄漏，最終致使菌體細胞發生裂解[2]。

潘凌子等[3]通過電子顯微鏡觀察發現，穿膜孔洞模型的作用機制是由于抗菌肽（如蜂毒肽）能夠引起菌體細胞穿孔或破裂，導致細胞質外流，從而使菌體發生裂解，最終死亡。

非膜裂解型的作用機制主要包括抑制細胞呼吸、生物大分子的合成及細胞壁的合成等。

Carlsson等[3]研究發現，40 μmol·L-1昆蟲防御素即可導致細菌細胞呼吸變弱，6 h后呼吸完全停止，這表明昆蟲防御素是通過抑制細菌的呼吸作用來產生抗菌效果的[4]。而蜂毒肽除了能夠誘導細菌細胞形成穿膜孔洞，還能夠抑制菌體與調控細胞分裂相關的蛋白合成，促使細胞分裂停滯于Ⅰ期（或 G1 期），進而影響細胞分裂。樗蠶素（attacin）可通過干擾大腸桿菌胞外膜蛋白OmpC、OmpF、OmpA和LamB基因的轉錄，從而抑制胞外蛋白的合成，最終改變細菌，尤其是革蘭氏陰性菌細胞膜的通透性，導致菌體死亡[5]。

麻蠅毒素Ⅱ（SarcotoxinsⅡ）由于無法維持正在形成中的細胞壁的正常形態，進而抑制細胞壁的形成，因此具有抗菌功效。麻蠅毒素Ⅱ對已形成的細胞壁則無任何影響[6]。

2.3 抗病毒活性作用機制

抗菌肽的抗病毒活性作用機制是利用抗菌肽與病毒蛋白具有相似性，從而阻止病毒對植物的侵染。如蜂毒肽及類似物K17的結構與煙草花葉病毒的衣殼蛋白的部分氨基酸序列存在相似性，以偽裝病毒包被蛋白干擾病毒正常組裝。

3 昆蟲抗菌肽在農業上的應用潛力

現今的農業生產中，越來越需要提高植物自身的抗性以適應不斷變化的環境。在農藥和畜牧業的飼料中，需要逐漸減少抗生素的使用。昆蟲抗菌肽作為農業中的新興抗菌藥物已被運用到各個方面，顯示了良好的應用潛力。

3.1 提高作物抗性

天蠶素是昆蟲抗菌肽的代表，其抗菌的高效快速性和對真核細胞的無毒性具有很高的應用價值。李乃堅等[7]構建雙價天蠶抗菌肽B基因和柞蠶抗菌肽D基因導入辣椒，獲得抗青枯病得T0代轉基因工程辣椒株系，經分子生物學檢測證明，抗菌肽D、B基因成功轉入辣椒，并在T0、T1、T2代呈現出明顯的抗青枯病性狀。劉清神等[8]在其基礎上，對T3代抗菌肽轉基因辣椒的l1個株系進行了PCR分子生物學檢測，證明T3代抗菌肽轉基因辣椒仍保持外源抗菌肽基因；對T3代轉基因辣椒群體進行了抗青枯病測定試驗，轉基因辣椒群體抗病力提高，表明在轉基因辣椒中天蠶抗菌肽D、B 基因得到了有效表達，從而減緩了青枯病癥狀。

董燕等[9]研究將一種新型融合抗菌肽基因轉入魚腥草，以培育抗菌活性增強、抗病害能力提高的魚腥草新品種。魚腥草作為一種常用中草藥，人工栽培后，其生長環境發生改變，抗病蟲害能力降低，試驗結果顯示抗菌肽Cecropin B和兔NP-1基因融合表達可提高魚腥草的抗病性。

王關林等[10]對植物的幼苗分別噴施5，20，50，100 mg·L-1蜂毒肽稀釋液后，幼苗的生理指標中，葉綠素含量表現為低濃度促進，高濃度稍有抑制；用蜂毒肽稀釋液浸種后，種子的呼吸強度隨著蜂毒肽的濃度提高而增強，證明了對種子的有氧呼吸，代謝速度有加快、提高的作用，并可以促進種子萌發，提高發芽率。浸種萌發后，幼苗的可溶性糖含量、葉綠素含量、核酸和蛋白質的含量變化情況與幼苗噴灑類似。5，50 mg·L-1噴施幼苗后，POD、SOD、PPO等植物防御酶活性在一定時間內比對照活性均有所升高，5 mg·L-1的中低濃度作用比較明顯，并且作用迅速。因此，蜂毒肽可以誘導植物細胞加強植物自身的防御系統。

Osusky等[11]分別將家蠶的天蠶素和蜂毒肽基因合成嵌合體（MsrA1）導入馬鈴薯植株中，在實驗室條件下獲得對早、晚疫病和軟腐病的抗性。

3.2 飼料添加劑

由于昆蟲抗菌肽分子量小，水溶性好，熱穩定性強，無免疫原性，對人畜無毒副作用，尤其防御素對革蘭氏陽性菌非常有效， 富含Gly的抗菌肽對革蘭氏陰性菌非常有效，它不是細胞毒素，可以被人體內的酶系降解、消化，因此昆蟲抗菌肽可以作為飼料添加劑。

昆蟲抗菌肽熱穩定性強體現在，可以在水中煮沸30 min不變性，能夠承受飼料生產中的高溫條件，可以被作為添加劑加入飼料中。例如用柞蠶抗菌肽制劑代替抗生素在斷奶仔豬飼料中的應用研究，就取得了很好的效果[12]。

何丹林等[13]添加蠶抗菌肽AD—酵母制劑500 g·t-1對雞小腸內容物酶活性、飼料能量和氮利用率及飼料中細菌和霉菌繁殖的影響研究表明，蠶抗菌肽AD—酵母制劑對粵黃雞小腸內容物中淀粉酶和蛋白酶活性和飼料營養價值無不良影響；對飼料中霉菌繁殖無抑制作用，但能有效地抑制飼料中的細菌繁殖；有希望成為傳統飼料抗菌劑的替代品。

黃永彤等[14]分別用抗菌肽與抗生素飼養肉食雞，比較發現抗菌肽喂養出的雞在出欄率、平均體重等指標中均無顯著差異，而且飼用抗菌肽的一組表現出對生長和免疫力的提高有促進作用，成活率提高10%。從而證明抗菌肽替代抗生素投入飼料中是可行的。并且經過毒理試驗證明，運用抗菌肽做飼料添加劑安全無毒副作用，且無污染無殘留。梁潔等[15]進一步研究證明，抗菌肽有預防與治療小雞呼吸道及消化道疾病，提高雞群存欄率，增加雞體質量和降低料肉比的作用，可作為抗生素類飼料添加劑代替物進行研究開發。

通過抗菌肽在酵母中的高效表達，產生的抗菌肽酵母制劑添加到飼料中，對預防和治療仔豬腹瀉、雛雞白痢和對蝦的病毒病都有很好的效果[16]。

3.3 食品保鮮

我國在食品工業中的防腐劑一直以苯甲酸、山梨酸及其鹽類和對羥基苯甲酸脂類等化學合成劑為主，使用防腐劑過多會影響身體健康。研究人員開始著眼于將昆蟲抗菌肽作為新型防腐劑，在食物產品保鮮中試驗應用，提高食用安全性，保持食品的營養價值、風味、顏色等。

在肉類品加工過程中，抗菌肽以很小的劑量就可以很好的控制菌群生長，保持肉的風味和色澤，同時能夠降低亞硝酸鹽的含量，從食用安全健康的角度考慮，是食品保鮮發展的新方向。

抗菌肽還可以應用于罐裝食品，在加工過程中，因改變了保鮮劑而調整了殺菌溫度。殺菌溫度的降低，可以為人們提供更好的食物品質和口感，并且延長了保質期。

茍仕金等[17]發明了轉基因蠅蛆抗菌肽用于食品防腐的方法，并申請了專利。該方法以轉基因蠅蛆為原材料， 經過數步的分離提取， 生產出用于食品防腐和蔬菜水果的保鮮劑。

抗菌肽還應用于熱加工食品，可以用來防止巴氏殺菌后的再污染，還可以用于防止食品發酵過程中的雜菌污染[18]。

羅富英等[19]運用0.01%～0.05%濃度范圍內的天然蠶蛹抗菌肽防腐溶液對鮮豬肉進行防腐試驗，發現濃度為0.05%蠶蛹抗菌肽防腐液對乳酸菌、微球菌、葡萄球菌抑菌效果分別高達89.0%，94.3%，98.8%。經過蠶蛹抗菌肽防腐液處理的鮮豬肉在室溫下能貯藏7 d，作為天然食品防腐劑的前景非常廣闊。

3.4 生物農藥

生物農藥是利用生物活體或由生物產生的活性成分 ，以及化學合成的具天然化合物結構的物質 ，制備出的可防治植物病蟲害和雜草及能調節植物生長的制劑。具有環境兼容性好，保護物種多樣性，對人畜無靶標生物威脅，來源廣泛的多種優點。對農業和環境的可持續性發展都有著重大的意義。

潘凌子等[3]將植物幼苗噴施不同濃度的蜂毒肽測定其防御酶活性，證實蜂毒肽能激活植物的防御酶系統，對植物有保護作用。蜂毒肽稀釋液浸種的試驗結果顯示，蜂毒肽對農作物種子萌發、生長發育無毒害。試驗還證明蜂毒肽對測試的13種農作物病原菌和4種致病菌均有抑制作用，其中包括了細菌性病原菌和真菌性病原菌，尤其對白菜軟腐病菌，蜂毒肽在μg級就可以發揮作用。不僅體現了抑菌譜廣、速效、高效等優點，而且可克服現有生物農藥存在的緩效性、低效性和抑菌譜窄等不足。在室溫范圍內， 蜂毒肽的抑菌作用對溫度不敏感，在各季節均能顯示出強效的抑菌作用。綜上，蜂毒肽可能作為理想的新生物農藥，突破現存的農藥發展瓶頸。

李志等[18]提出柞蠶還是重要的動物生物反應器資源，利用其可研究開發許多有益抗菌肽、 生物農藥，并能為提高農村收入，保障千億斤糧食產能工程的糧食安全做貢獻。

4 展 望

由于昆蟲體內抗菌肽含量低，分離純化難度大，成本高，梁潔等[20]運用轉基因酵母菌在500 L罐中發酵，其發酵液的殺菌效價達到6 734 IU·mL-1，抗菌肽產量高且穩定，但應用于大規模生產還需要更進一步的研究和探索。在轉基因領域中，昆蟲抗菌肽也逐漸成為研究的熱點項目，尤其在農業轉基因抗性植物中特別被推崇。在臨床試驗中也證實昆蟲抗菌肽是選擇性殺傷，暫無對寄主細胞傷害作用的報道，所以可以應用于抗菌、抗腫瘤、抗病毒的醫藥，生物農藥和水產養殖等產業中。從昆蟲抗菌肽的作用機制作為突破口，可以更深入了解其藥理藥效，準確的應用于各個領域。

參考文獻：

[1] Helmerhorst E J， Van’t H W， Breeuwer P.Characterization of histatin 5 with respect to amphipathicity， hydrophobicity， and effects on cell and mitochondrial membrane integrity excludes a candidacidal mechanism of pore formation[J].Journal of Biological Chemistry， 2000， 276（8）： 5643-5649.

[2] Bessin Y， Saint N，Marri L， et al. Antibacterial activity and pore-forming properties of ceratotoxins： A mechanism of action based on the barrel stave model[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - Biomembranes， 2004， 1667（2）： 148-156.

[3] 潘凌子，那杰，邢卓，等.蜂毒肽對農作物病原菌的抑殺作用[J].科學通報， 2007， 52（3）： 291-296.

[4] Carlsson A， Engstr?m P，Palva E T， et al. Attacin， an antibacterial protein from Hyalophora cecropia， inhibits synthesis of outer membrane proteins in Escherichia coli by interfering with omp gene transcription[J]. Infect Immun， 1991， 59（9）： 3040-3045.

[5] Sharma A ，Sharma R，Imamura M， et al. Transgenic expression of cecropin B， an antibacterial peptide from Bombyx mori， confers enhanced resistance to bacterial leaf blight in rice[J]. FEBS Lett， 2000， 484（1）： 7-11.

[6] Ando K， Natori S. Inhibitory effect of sarcotoxin IIA， an antibacterial protein of Sarcophaga peregrina， on growth of Escherichia coli[J]. Faculty of Pharmaceutical Sciences， 1988， 103（4）： 735-739.

[7] 李乃堅，余小林，李穎，等.雙價抗菌肽基因轉化辣椒[J].熱帶作物學報， 2000， 21（4）： 45-41.

[8] 劉清神，李乃堅，黃自然，等.T3代抗菌肽轉基因辣椒的PCR檢測及青枯病抗性測定[J]. 廣東蠶業， 2005， 39（2）： 20-24.

[9] 董燕，張瑩，易浪，等. 抗菌肽cecropinB和兔NP_1融合基因轉化魚腥草的研究[J].中國中藥雜志， 2010， 35（13）： 1160-1165.

[10] 王關林，邢卓，潘凌子，等.蜂毒肽對農作物生理指標及防御系統酶影響的研究[J].作物學報， 2006， 32（4）： 593-596.

[11] Osusky M，Zhou G， Osuska L， et al. Transgenic plants expressing cationic peptide chimeras exhibit broad-spectrum resistance to phytopathogens[J]. Nat Biotech， 2000， 18（11）： 1162-1166.

[12] 金小寶， 朱家勇. 昆蟲抗菌肽及其應用[J].中國寄生蟲病防治雜志， 2004， 17（2）： 125-127.

[13] 何丹林， 溫劉發， 鄧春柳，等.蠶抗菌肽AD-酵母制劑對粵黃雞腸道消化酶和飼料品質的影響[J].中國家禽， 2004， 26（7）： 9-10.

[14] 黃永彤， 黃自然，黃建清，等.抗菌肽與抗生素飼喂肉雞的效果比較[J].廣東飼料， 2004， 13（2）： 24-25.

[15] 梁潔， 李運南， 董加喜.抗菌肽飼喂肉雞的應用研究[J].現代食品科技， 2009， 25（4）： 416-434.

[16] 文加才， 秦永忠， 宋愛剛.陽離子抗菌肽的研究進展[J].國外醫藥（抗生素分冊）， 2002， 23（6）： 267-271.

[17] 茍仕金，茍鴻鷹，王成余.轉基因家蠅蛆中提取的基因抗菌肽用于食品防腐和蔬菜水果保鮮劑：中國，01106362.9[P]. 2001-10-31.

[18] 李志， 王東風，張慶良.黑龍江省蠶業資源綜合利用產業現狀及展望[J].北方蠶業， 2010， 31（4）： 1-3.

[19] 羅富英， 寧學林， 吳桂枝，等.天然蠶蛹抗菌肽對鮮豬肉的防腐抑菌效果研究[J].食品工業科技， 2010， 31（3）： 117-118.

[20] 梁潔，彭中健，梁淑娃，等.轉基因酵母菌深層發酵生產抗菌肽的研究[J].現代食品科技， 2009， 25（6）： 639-645.