大麻素受體1在大鼠非酒精性脂肪性肝病的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要] 目的 觀察大麻素受體1（CB1R）在大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型中的表達(dá)情況，并使用CB1R拮抗劑利莫那般評價(jià)對NAFLD的治療作用，探究其可能機(jī)制。方法 采用高糖高脂飼料（HSHF）建立大鼠NAFLD模型，分組并連續(xù)給藥8周，取動物血清和肝臟，通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測肝組織CB1R在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)情況，通過蘇木素-伊紅染色（HE）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、血清生化檢測，觀察利莫那般對肝臟組織病理學(xué)、肝功能酶學(xué)、血脂等的影響。 結(jié)果 CB1R在模型組的表達(dá)與對照組、干預(yù)組比較顯著增加（P <0.01），利莫那般可逆轉(zhuǎn)肝組織脂肪變性，降低血清leptin、TNF-α、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）的含量，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 采用HSHF飼料喂養(yǎng)大鼠30 d成功建立NAFLD模型，CB1R拮抗劑有望成為NAFLD治療的潛在靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 非酒精性脂肪肝；大麻素受體1；利莫那般

[中圖分類號] R575.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）03-0025-03

NAFLD是一種無過量飲酒史、病理組織學(xué)表現(xiàn)為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和炎癥浸潤為特征的臨床病理綜合征，與肥胖、胰島素抵抗、脂代謝紊亂等密切相關(guān)。內(nèi)源性大麻素物質(zhì)是一類由酰胺、酯類和長鏈不飽和脂肪酸組成的新脂質(zhì)介質(zhì)，他們能激活特異的大麻素受體，即CB1和CB2[1]。參與機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)，正是由于CB1對脂代謝的影響提示，CB1R及其受體拮抗劑的研究可能為脂肪肝的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及飼料 普通級雄性SD大鼠（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供）42只，鼠齡約6～8 w，體重180～220 g。HSHF配方如下[2]：標(biāo)準(zhǔn)普通飼料（Standard Chow，簡寫SC）72.8%、豬油10%、膽固醇2%、蛋黃粉5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、蔗糖10%。

1.1.2 藥品和試劑 利莫那般購自濟(jì)南偉都化工有限公司。ALT、AST、TG、TC試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Leptin、TNF-α試劑盒購自上海西塘生物科技有限公司。CB1抗體購自博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，完全隨機(jī)分組。對照組12只，予SC喂養(yǎng)至12 w，4 w、12 w分別處理6只；模型1組12只，予HSHF至12 w，4 w、12 w分別處理6只；模型2組6只，予HSHF喂養(yǎng)4 w后，予SC喂養(yǎng)至12 w；干預(yù)1組6只，予HSHF喂養(yǎng)4 w后，予HSHF+利莫那般20 mg/（kg·day）腹腔注射至12 w；干預(yù)2組6只，予HSHF喂養(yǎng)4 w后，予SC+利莫那般20 mg/（kg·day）腹腔注射至12 w。

1.2.2 血生化指標(biāo)檢測 嚴(yán)格按說明書測定血清中TG、TC、ALT、AST的含量及活性。

1.2.3 ELISA檢測 按照ELISA試劑盒檢測Leptin、TNF-α含量，結(jié)果用ELISA軟件統(tǒng)計(jì)處理。

1.2.4 病理學(xué)檢查 大鼠肝臟組織標(biāo)本以10%中性福爾馬林液固定，浸蠟包埋切片，經(jīng)乙醇梯度脫水進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以x±s表示。兩組比較采用t檢驗(yàn)，同一指標(biāo)的組間比較采用方差分析，以P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1造模

模型1組4 w大鼠攝食高糖高脂肪飼料30 d，肝臟體積增大，外觀呈局灶性奶白色變性灶，對照組4 w大鼠肝臟大小正常；血清中TG、TC、ALT、AST顯著升高（P < 0.05），見表1；肝臟病理組織學(xué)顯示肝細(xì)胞胞質(zhì)中充滿大小不等的圓形脂肪空泡，主要為彌漫性大泡性脂肪變性，證明NAFLD模型建立成功。 見圖1。

表1 造模30 d大鼠血清生化指標(biāo)的比較（x±s，n = 6）

注：△與對照組4 w比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）

圖1 大鼠肝臟HE染色結(jié)果（肝組織HE染色×250）

2.2 肝組織CB1R免疫組織化學(xué)染色表達(dá)

CB1R主要在胞漿內(nèi)著色，平均灰度值與其表達(dá)成反比。對照組12 w中CB1R在上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞低表達(dá)；高脂飲食誘導(dǎo)CB1R主要表達(dá)在肝細(xì)胞和門靜脈周圍，與對照組12 w比較，模型1組12wCB1R表達(dá)明顯增加（P < 0.01）；加入CB1R拮抗劑后，與對照組12 w和模型1組12 w比較，干預(yù)1組CB1R表達(dá)明顯降低（P < 0.01）。見表2。

2.3 CB1R表達(dá)、leption和TNF-α的相關(guān)性分析

高脂飲食誘導(dǎo)肝臟表達(dá)CB1R上調(diào)，模型1組CB1R的表達(dá)情況與leptin、TNF-α呈明顯正相關(guān)，各相關(guān)系數(shù)分別為：與leptin（r = 0.619，P < 0.05），與TNF-α（r = 0.615，P < 0.05）。

2.4 CB1受體拮抗劑對大鼠NAFLD的作用

2.4.1 組織病理學(xué)觀察 模型1組12 w肝細(xì)胞仍有空泡樣變，部分肝小葉和匯管區(qū)可見以單核細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤；模型2組可見小泡性脂肪變性；干預(yù)組肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)尚可，脂肪滴減少，肝細(xì)胞脂變情況和炎癥程度均有明顯改善。 見圖1。

2.4.2 測量指標(biāo)觀察 體重：模型1組12 w、模型2組大鼠體重顯著高于對照組12 w（P < 0.01）；干預(yù)1、2組大鼠給藥后體重迅速下降，明顯低于模型1組12 w、模型2組，但仍高于對照組12 w（P < 0.01）。肝重：模型1組12 w、模型2組肝重顯著高于對照組12 w（P < 0.01）；干預(yù)1組、干預(yù)2組肝重低于同期對照組（P < 0.01），干預(yù)2組肝重低于模型2組（P < 0.01）。血清leptin、TNF-α：模型1組12 w、模型2組大鼠血清leptin、TNF-α較于同期對照組明顯升高，干預(yù)1組較于模型1組12 w，血清leptin、TNF-α明顯減低（P < 0.01）。血清生化指標(biāo)：與對照組12 w比較，模型1組12 w中ALT、AST、TG、TC含量顯著升高（P < 0.01）；與模型1組12 w比較，干預(yù)1組ATL、AST、TC明顯降低（P < 0.01）；與模型2組比較，干預(yù)2組ALT、AST顯著降低（P < 0.01）。見表3，4。

3 討論

3.1 動物模型的建立

目前脂肪肝的動物模型建立方法以高脂飼料誘導(dǎo)法最常用，但此法不太符合現(xiàn)代人“高糖+高脂”的飲食結(jié)構(gòu)。胡克章、楊坤[2]等人采用高糖高脂肪飼料喂養(yǎng)SD大鼠30 d，成功建立以重度脂肪肝為主的NAFLD模型，且停止造模后30 d該模型基本穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)研究遵循現(xiàn)代人類的飲食習(xí)慣，采用上述方法建立NAFLD動物模型。

3.2 CB1受體

CB1R存在于體內(nèi)多種細(xì)胞表面，包括下丘腦、肝細(xì)胞、肌肉組織等。在肝臟，高脂飲食誘導(dǎo)CB1R，進(jìn)而激活肝臟脂肪合成基因主要轉(zhuǎn)錄因子（SREBP-1c）及其靶酶乙酰Co羧化酶（ACC-1）和脂肪酸合成酶（FAS），促進(jìn)脂肪酸的合成；同時(shí)抑制脂肪β-氧化靶酶肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）活性，減少脂肪β-氧化，體內(nèi)甘油三脂增加，致使肥胖和脂肪肝[3]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，高脂飲食刺激下丘腦以及邊緣系統(tǒng)產(chǎn)生更多的AEA和CB1R，CB1受體增加SREBP-1c和FAS，F(xiàn)AS的增加促進(jìn)食欲[4]。而加入利莫那般后，同時(shí)抑制上述兩條途徑，作用于下丘腦短暫地抑制食欲，作用于肝臟，增強(qiáng)線粒體的功能，增加脂肪氧化和能量的消耗，本實(shí)驗(yàn)中利莫那般干預(yù)組大鼠攝食量明顯減少，體重緩慢減少。

3.3 CB1受體與NAFLD

CB1R參與脂質(zhì)代謝，與肥胖、糖尿病等代謝綜合征密切相關(guān)。而NAFLD是代謝綜合征和胰島素抵抗在肝臟表現(xiàn)。目前普遍認(rèn)為胰島素抵抗是發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而脂肪因子在誘導(dǎo)和加重胰島素抵抗中發(fā)揮著重要作用。TNF-α是造成肝細(xì)胞損傷的主要因子，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤，加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。同時(shí)，高濃度的TNF-α可減少外周組織脂肪分解，促進(jìn)肝細(xì)胞TG的合成與聚集，加快脂肪肝的形成。楊盈盈[6]等人探究TNF-α和大麻素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，TNF-α通過NF-kB信號通路激活大麻素系統(tǒng)，進(jìn)而加重細(xì)胞β-氧化。而Jourdan[7]的研究表明，CB1R能增加脂肪組織表達(dá)TNF-α。本實(shí)驗(yàn)中，模型1組大鼠CB1R表達(dá)與血清中TNF-α含量明顯正相關(guān)，而且利莫那般干預(yù)后，相較于模型1組12 w，TNF-α明顯降低，我們推斷CB1R可能主要是通過降低血清TNF-α從而在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中也扮演重要角色。另一個(gè)脂肪細(xì)胞因子瘦素，ChitturiS[8]等人報(bào)道血清瘦素水平直接與肝脂肪變的程度相關(guān)，并且其含量在NAFLD患者明顯升高，而理論上瘦素能增加脂肪分解，減少合成，可見瘦素與肝脂肪變性的關(guān)系可能反映瘦素在肝性胰島素抵抗中的作用，即外周瘦素抵抗。本實(shí)驗(yàn)中，利莫那般干預(yù)后瘦素水平下降，肝脂肪變性程度減弱，可推斷肝臟CB1R致使瘦素抵抗，其拮抗劑改善瘦素抵抗。可見，CB1R和脂肪因子相互關(guān)聯(lián)、相互影響共同參與NAFLD的發(fā)病環(huán)節(jié)，但是通過何種機(jī)制和途徑實(shí)現(xiàn)的，是否與上述學(xué)者的研究有共通之處還需進(jìn)一步地研究證實(shí)。

3.4利莫那般

近年來NAFLD發(fā)病率逐年增高，但目前對該病的干預(yù)僅僅是改善飲食和生活方式。考慮藥物本身抑制食欲，我們分別設(shè)計(jì)了高脂飲食和普通飲食下藥物的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示干預(yù)組大鼠體重較于相應(yīng)對照組和模型組有明顯減輕，肝臟病理HE表明利莫那般可逆轉(zhuǎn)肝組織脂肪變性，而普通飲食可減輕脂肪變性程度；藥物能減少血清中l(wèi)eptin和 TNF-α，改善瘦素抵抗，阻止炎癥因子作用，進(jìn)一步阻止NAFLD向纖維化方向進(jìn)展；生化指標(biāo)中，ALT、AST在干預(yù)組中明顯下降，與相應(yīng)模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但TG在相應(yīng)干預(yù)組和模型組中比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TC在干預(yù)2組和模型2組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與動物例數(shù)、藥物治療的療程和劑量有關(guān)，有待更多的實(shí)驗(yàn)研究。

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（收稿日期：2012-11-20）