纖支鏡檢查聯(lián)合BALF細胞p53突變的檢測對肺癌的診斷價值

[摘要] 目的 探討纖支鏡檢查聯(lián)合支氣管肺泡灌洗液中細胞p53突變檢測對肺癌的診斷價值。方法 對可疑肺癌患者行纖支鏡檢查，并以聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）分析法檢測BALF細胞p53的第5、6、7、8外顯子突變情況。 結(jié)果 在最終確診的68例肺癌患者中，纖支鏡檢查診斷肺癌49例， p53突變檢測發(fā)現(xiàn)37例，纖支鏡檢查與檢測BALF中細胞p53突變聯(lián)合的方法共同檢出61例肺癌患者，陽性率高達89.7%，較單獨纖支鏡檢查差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。結(jié)論 PCR-SSCP法檢測BALF中p53突變可彌補纖支鏡檢查的不足，有助提高肺癌的診斷率。

[關(guān)鍵詞] 肺癌；纖支鏡檢查；支氣管肺泡灌洗液；p53基因；基因突變

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）03-0062-03

肺癌是對人類健康和生命威脅最嚴重和最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率逐年上升。世界范圍內(nèi)其發(fā)病率居各腫瘤之首[1]。但對肺癌患者的診斷和鑒別卻是臨床工作的難點。目前纖支鏡在臨床應(yīng)用非常廣泛，因其能進行活檢和細胞學檢查，對病變性質(zhì)的判斷有著重要意義，但對肺癌診斷的靈敏性取決于腫塊的位置、大小、形態(tài)等因素，對直徑小于2 cm的周圍型病變診斷率則較低[2]。現(xiàn)代分子生物學研究認為，腫瘤的發(fā)生與基因變化有關(guān)，癌基因的活化和抑癌基因的突變是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因之一，本實驗通過檢測支氣管肺泡灌洗液中細胞p53突變，旨在彌補纖支鏡在肺癌診斷中的不足，尋求敏感的肺癌診斷新方法。

1 資料與方法

1.1 一般材料

選取2006年1月～2011年12月臨床上可疑的肺癌患者82例，男48例，女34例，年齡23～72歲，平均（58.3±8.6）歲，均具有完整的臨床資料，所有病例均經(jīng)病理學或細胞學確診，其中肺癌患者68例，肺結(jié)核、炎性假瘤等良性病變14例。肺癌組中鱗癌38例，腺癌21例，其他9例；根據(jù)2002年UICC制訂的標準行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期27例；分化程度為高、中分化者36例，低、未分化者32例。所取病例均排除其他系統(tǒng)腫瘤以及風濕病、糖尿病等疾病。

1.2 纖維支氣管鏡檢查

采用日本Olympus纖維支氣管鏡，按常規(guī)進行支氣管鏡檢查。2%的利多卡因局部麻醉后，根據(jù)影像學提供的病變位置，將纖維支氣管鏡經(jīng)鼻腔插入肺部支氣管病變處，對病變肺段進行支氣管肺泡灌洗，經(jīng)活檢孔快速注入預熱為37 ℃的無菌生理鹽水，負壓吸引回收，共灌洗兩次，回收液過濾后3000 r/min離心10 min，棄上清留細胞沉淀-80 ℃保存。隨后對病變部位進行活檢和刷片，標本分別送病檢和細胞學檢查。

1.3 DNA提取

采用常規(guī)蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇抽提法提取DNA，無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌，pH8.0的Tris-EDTA溶液50 μL溶解。以紫外分光光度法測定DNA的純度及濃度，A260/A280比值在1.8～2.0之間可用于下一步實驗。若DAN純度<1.6， 表明有殘存酚或蛋白含量太高，應(yīng)用氯仿再次抽提純化。提取的DNA產(chǎn)物分裝保存于-20℃冰箱。

1.4 PCR擴增

選擇常發(fā)生突變的研究熱點p53的5～8外顯子[3]，引物設(shè)計參考文獻[4，5]，序列如下，第5外顯子：5'-TTC CTC TTC CTG CAG TAC TC和5'-CAG CTG CTC ACC ATC GCT AT；第6外顯子：5'-ACA GGG CTG GTT GCC CAG GGT和5'-AGT TGC AAA CCA GAC CTC AGG CG；第7外顯子：5'-TCC TAG GTT GGC TCT GAC TGT和5'-AGT GGC CCT GAC CTG GAG TCT；第8外顯子：5'-GGG ACA GGT AGG ACC TGA TTT CCT T和5'-ATC TGA AGG CAT AAC TGC ACC CTT GG，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：10×TaqDNA 聚合酶緩沖液（含Mg2+） 5 μL，10 mM dNTP 1 μL，25 mM MgCl2 4 μL，上、下游引物（10 mM）各1 μL ，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 0.2～0.3 μg，補ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，54℃～62℃退火40 s，72℃延伸60 s，共36個循環(huán)，72℃再延伸10 min。反應(yīng)完成后，取5μL產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增情況，如出現(xiàn)清晰的目的條帶，且無雜帶的PCR產(chǎn)物，可行SSCP分析。

1.5 SSCP分析

將PCR擴增產(chǎn)物與變性上樣液（98%甲酰胺，10 mM EDTA，0.03%二甲苯青，0.05%溴酚藍）1︰2混合，98℃變性10 min，冰浴驟冷5 min，快速上樣于8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（交聯(lián)度29∶1），5 V/cm垂直電泳，電泳緩沖液為1×TBE，電泳4～6 h。取下凝膠進行銀染，于暗室中硝酸銀染色30 min，3%碳酸鈉顯色，至凝膠出現(xiàn)褐色條帶，背景為透明的淡黃色時棄去染色液，10%冰醋酸終止顯色，于凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存。用對照組擴增的SSCP帶型作為陰性對照，如出現(xiàn)單鏈DNA條帶數(shù)目的增加﹑減少或位置的相對移位則判斷為有突變發(fā)生。

1.6 統(tǒng)計學分析

本組所得數(shù)據(jù)行χ2檢驗，數(shù)據(jù)統(tǒng)計在SPSS 13.0軟件上進行，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR-SSCP檢測結(jié)果

p53各外顯子均擴增出了相應(yīng)的PCR產(chǎn)物（圖1）。SSCP分析發(fā)現(xiàn)，對照組14例均未發(fā)現(xiàn)突變，肺癌組68例中有37例發(fā)生突變，突變發(fā)生率為54.4%（圖2）。其中男性21例（21/40），女生16例（16/28），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.143， P > 0.05）。按病理分類，鱗癌26例（68.4%，26/38），腺癌7例（33.3%，7/21），其他4例（44.4%，4/9），鱗癌與腺癌中突變比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.756，P < 0.01）。按TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期突變20例（48.8%，20/41），Ⅲ～Ⅳ期突變17例（63.0%，17/27），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.320，P > 0.05）。按分化程度，高、中分化者突變14例（38.9%，14/36），低、未分化者突變23例（71.9%，23/32），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.431，P < 0.01）（表1）。檢出各外顯子突變情況：第5外顯子7例，第6外顯子10例，第7外顯子8例，第8外顯子12例。

2.2 纖支鏡檢查結(jié)果和聯(lián)合檢測的評價

本組病例中，通過活檢經(jīng)組織病理學診斷肺癌46例，通過刷檢經(jīng)細胞病理學診斷肺癌40例。活檢和刷檢共診斷肺癌49例，通過刷檢細胞學檢查使纖支鏡對肺癌的診斷率從67.1%提高到72.1%。68例肺癌患者中，通過纖支鏡活檢和細胞學檢查共發(fā)現(xiàn)49例，檢測BALF中p53突變發(fā)現(xiàn)37例。37例p53突變的患者有12例在纖支鏡活檢和細胞學檢查中無特殊發(fā)現(xiàn)，而最終通過手術(shù)病理證實為肺癌。二者聯(lián)合共診斷檢出肺癌61例，陽性率為89.7%，與單獨纖支鏡檢查（72.1%）的差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2=6.848，P < 0.01）。

3 討論

纖支鏡檢查在臨床應(yīng)用廣泛，是肺癌診斷的重要手段[6，7]。通過對病變部位支氣管鉗夾活檢、刷檢、經(jīng)支氣管針吸活檢等，纖支鏡可對大部分病例進行有效診斷。然而，鉗夾活檢、刷檢對直徑大于2 cm且外向型生長的腫塊有較高的診斷率，但仍有部分肺癌，特別是周圍型肺癌診斷較為困難[2]。另外，在纖支鏡檢查時，選擇怎樣的聯(lián)合策略一直以來倍受爭議[8]。本實驗通過在纖支鏡檢查時，利用活檢、細胞學聯(lián)合敏感基因突變的方法，探索其在肺癌診斷中的應(yīng)用價值。

既往研究證實，基因突變存在于人體的多種體液細胞中，對這些體液細胞中的基因?qū)W檢測有助于腫瘤的診斷。Tobi等[9]通過結(jié)腸洗滌液中K-ras基因突變情況用于結(jié)腸腫瘤的診斷和鑒別，支氣管肺泡灌洗液在肺癌診斷中的價值已有大量的研究報道[10， 11]。Oshita等[12]研究發(fā)現(xiàn)，檢測支氣管肺泡灌洗液中K-ras突變對肺癌診斷敏感性可高達75% 。因此，檢測BALF中的敏感基因突變可能是一個有效的肺癌輔助診斷方法，是探索肺癌診斷新方法的努力方向。

p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因之一，在人類一半以上的惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)有p53基因的異常，約50%非小細胞肺癌和70%小細胞肺癌患者存在有p53突變[13，14]。本研究通過對p53突變的檢測，發(fā)現(xiàn)能彌補纖支鏡檢查的不足，二者聯(lián)合對肺癌診斷率高達89.7%，較單獨纖支鏡檢查差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。本組實驗數(shù)據(jù)顯示，性別并不是p53突變發(fā)生的危險因素。p53突變在不同的TNM分期中也無統(tǒng)計學意義，提示p53突變可能是肺癌發(fā)生中的早期事件。本研究還發(fā)現(xiàn)，p53突變在鱗癌和腺癌患者之間，以及不同分化程度的組別之間差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），因而檢測BALF中p53突變對肺癌的臨床病理分型和預后的判定可能具有一定的指導意義。

本研究不足在于，不同位置、大小和形態(tài)的腫塊纖支鏡檢查陽性率有所不同[2]，因病例數(shù)有限而未對不同類型腫塊分別評價聯(lián)合檢測的價值。但是鑒于任何腫塊通過纖維支氣管鏡檢查靈敏度有限的前提下，檢測BALF細胞中p53突變可彌補其不足并提高陽性率。同時，纖維支氣管鏡活檢存在一定的風險，有些患者不能接受或存在某些禁忌，如凝血功能障礙或血壓過高等安全問題而限制其應(yīng)用。此時，檢測BALF中p53突變不失為一種很好的診斷方式，因其安全性高、并發(fā)癥少更能廣泛應(yīng)用于臨床。

綜上所述，檢測BALF中p53突變可彌補纖支鏡檢查的不足，二者聯(lián)合有助提高對肺癌的診斷率，對肺癌的診斷有著重要意義，并對臨床病理分型和預后的判定可能具有一定的指導價值。由于腫瘤發(fā)生的分子生物學基礎(chǔ)是基因的異常，基因的改變常先于臨床癥狀的出現(xiàn)，檢測BALF中p53突變甚至還可以達到對肺癌早期診斷的效果。

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（收稿日期：2012-11-26）