PPAR—γ在兔二次打擊MODS模型中的表達

[摘要] 目的 探討過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator -activated receptor γ， PPAR-γ）在二次打擊多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）中的表達。 方法 采用Wiggers′法造成兔失血性休克并給予液體復蘇，6 h后腹腔注射脂多糖（LPS）引起MODS，24h后取肝臟組織，RT-PCR法半定量分析肝臟組織中PPAR-γ的表達。 結果 兔肝臟中PPAR-γ mRNA的表達，在創傷失血空白組及二次打擊空白組中，其表達較假手術組明顯下降（P < 0.05），但兩組之間沒有顯著差異（P > 0.05）。在創傷失血組及二次打擊組中，羅格列酮能上調PPAR-γ的表達（P < 0.05），GW9662能抑制PPAR-γ的表達（P < 0.05）。 結論 PPAR-γ在二次打擊MODS模型中的表達是下降的，羅格列酮能上調其表達，GW9662能夠阻斷羅格列酮對PPAR-γ的上調。

[關鍵詞] PPAR-γ；MODS；二次打擊

[中圖分類號] R459.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）03-0021-02

在外科中，由于創傷、感染、休克等因素影響，經常會出現多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），由于在診斷及治療上的困難，導致其病死率極高，成為當今急危重癥醫學領域的重大挑戰。過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）是一種依賴配體活化的轉錄因子，屬于核激素受體超家族成員，基于其對炎癥反應的調控作用，為MODS的研究提供了新的研究方向。在我課題組已有的研究中[1]，已經在脂多糖（LPS）誘導的MODS動物模型中證實其能夠減輕炎癥反應，而PPAR-γ在二次打擊引起的MODS中的作用的相關研究尚少。本實驗通過在失血性休克并內毒素誘發的二次打擊兔MODS模型中監測PPAR-γ的表達，探討其在雙相遲發型MODS中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物及分組

脂多糖（LPS）、GW9662及二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；羅格列酮（ROSI，商品名：文迪亞）購自葛蘭素史克有限公司；RT-PCR試劑盒（Toyobo公司）。健康雄性日本大耳兔，體重（2000±100）g，購自于西安交通大學醫學院動物實驗中心。將56只兔隨機分為7組，每組8只，分別為：①假手術組（sham空白組）：僅給予手術分離股動脈。創傷失血組（trauma-hemorrhage group，T-H組）：②創傷失血空白組，T-H空白組）僅予以失血性休克及液體復蘇，之前30 min給予耳緣靜脈注射10%DMSO 1 mL/kg；（2-1創傷失血-羅格列酮組，T-H-R組）予以失血性休克及液體復蘇，之前30 min給予經耳緣靜脈注射羅格列酮（溶于10%DMSO中）3.12 mg/kg；（2-2創傷失血-GW9662，T-H-G組），予以失血性休克及液體復蘇，之前30 min經耳緣靜脈注射羅格列酮（溶于10%DMSO中）3.12 mg/kg，15 min注射GW9662（溶于10%DMSO中）0.156 mg/kg。③二次打擊組（double-hit group，D-H組）：（3-1，二次打擊空白組，D-H空白組）僅予以失血性休克及液體復蘇后LPS刺激，并給予耳緣靜脈注射10%DMSO 1 mL/kg；（3-2，二次打擊-羅格列酮組，D-H-R組）予以失血性休克液體復蘇及LPS刺激，LPS刺激之前30 min給予經耳緣靜脈注射羅格列酮（溶于10%DMSO中）3.12 mg/kg；（3-3，二次打擊- GW9662，D-H -G組）予以失血性休克液體復蘇及LPS刺激，LPS刺激之前30 min經耳緣靜脈注射羅格列酮（溶于10%DMSO中）3.12 mg/kg，15 min注射GW9662（溶于10%DMSO中）0.156 mg/kg。

1.2 二次打擊MODS模型的制備和取材

參照Wiggers′法造成低血容量性休克，以3%戊巴比妥鈉（1mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉。麻醉成功后分離股動脈插管接三通，監測血壓至正常15 min內快速放血（血液肝素化后室溫保存），維持動脈壓在6.0～7.3 kPa之間1 h時。休克終點快速回輸失血和1倍失血量的林格液，時間不少于30 min，維持血壓至穩定（如有必要注射血管活性藥物）。6 h后，經腹腔注射LPS 10 μg/kg，放回籠中觀察，自由飲水進食。24 h后快速放血處死兔，取血觀察其相關生化指標的改變及觀察動物內臟變化及游離氣管和肺臟，取出全肺計算肺系數，以判斷MODS模型建立成功。隨后取兔肝臟組織以備實驗。

1.3 引物設計

參照Halvorsen等方法和Genebank序列，Premier5.0軟件設計引物（北京三博遠志生物技術有限責任公司合成）。PPAR-γ引物：上游5'-TGACAGGAA AGACGACAGACAAATC，下游5'-CCACTGAGAATGATGACGGCTATG。GAPDH引物：上游5'-GATTCCACCCAC GGCAAGTTC，下游5'-ACTCGGCACCAGCATCACC。

1.4 肝組織PPAR-γ mRNA的表達

將PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析系統對其進行圖像掃描，采用LEICAQ-500IW圖像分析處理系統進行分析測定光密度OD值，以目的片段的OD值和GAPDH的OD值之比作為PPAR-γ的表達水平。

1.5 統計學處理

計量數據采用均數±標準差（x±s）表示，應用SPSS13.0軟件分析，進行方差分析及t檢驗，P < 0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 各空白組PPAR-γ mRNA在各組兔肝臟組織中的表達

各組兔肝臟中PPAR-γ mRNA的表達結果見表1。T-H空白組較之sham空白組中PPAR-γ mRNA的表達下降，具有顯著性差異（t = 2.7447，P < 0.05），D-H空白組較之sham空白組中PPAR-γ mRNA的表達下降，具有顯著性差異（t = 2.7377，P < 0.05），而T-H組與D-H組中PPAR-γ mRNA的表達無統計學意義（t = 0.2476，P > 0.05）。

2.2 T-H組及D-H組中PPAR-γ mRNA在各組兔肝臟組織中的表達

在T-H組中，兔肝臟組織中PPAR-γ mRNA的表達結果見表1。羅格列酮組較空白組明顯升高，具有顯著差異（t = 9.132 9，P < 0.05）。GW9662組較之羅格列酮組明顯下降，具有統計學意義（t = 9.440 4，P < 0.05）。在D-H組中，兔肝臟組織中PPAR-γ mRNA的表達結果見表1。羅格列酮組較空白組明顯升高，具有顯著性差異（t = 8.615 5，P <0.05）。GW9662組較之羅格列酮組明顯下降，具有統計學意義（t = 9.632 4，P < 0.05）。

3 討論

臨床中的MODS往往是多元性和序貫性損傷的結果，而不是單一打擊的結果。根據Dietch提出MODS的二次打擊學說，將創傷、感染、燒傷、休克等早期直接損傷作為第1次打擊，雖不足以引起明顯的臨床癥狀，但早期損傷激活了機體免疫系統，炎癥細胞已經動員起來，處于預激活狀態[2]。如病情進展惡化或繼發感染、休克等情況，則構成第二次打擊，使處于預激活狀態的機體免疫性系統爆發性激活，大量炎癥細胞活化、炎癥介質釋放，結果炎癥反應失控，導致組織器官的致命性損害。因此，通過對炎癥因子的調節，阻斷炎癥反應的過程，改善組織器官的功能成為MODS診斷和治療的新途徑，有許多學者都希望通過這一途徑調節免疫反應，治療MODS[3]。

PPAR-γ能夠通過調節如TNF-α、IL-6、ICAM-1及NF-κB等炎癥因子表達，參與機體炎癥反應過程，抑制單核-巨噬細胞活化，減輕炎癥細胞浸潤和減少炎性介質釋放等而發揮抗炎作用[4]。PPAR-γ配體或激動藥分為天然和合成兩大類。15d-PGJ2是目前最強的PPAR-γ天然激動劑，但15d-PGJ2在活體中存在極少。噻唑烷二酮（TZDs）類藥物是PPAR-γ的高親和力合成配體，其代表藥物包括曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮、環格列酮等，均可在毫微克分子濃度水平激活PPAR-γ，因此在本課題組先前的研究中發現，在由LPS誘導的MODS動物模型肝臟組織中，LPS通過CD14/TLR4等途徑激活NF-κB，從而引起炎癥介質的大量釋放。而PPAR-γ的激動劑羅格列酮能夠上調巨噬細胞中PPAR-γ的表達，通過抑制NF-κB，抑制促炎因子TNF-α、IL-12、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和NO等的產生，促進抑炎因子IL-10等的產生。PPAR-γ使促炎因子和抑炎因子的表達平衡重新建立，抑制炎癥反應的過度發展，防止了全身炎癥反應綜合癥（SIRS）的發生，進而保護了組織器官，而GW9662作為PPAR-γ激動劑的拮抗劑，抑制了激動劑的作用，出現了SIRS，進一步可以引起MODS[1，5]。本實驗通過建立由失血性休克后液體復蘇及LPS刺激的方法建立了二次打擊MODS模型，從而探討PPAR-γ在二次打擊MODS模型的不同的階段，在肝臟組織中的表達。我們觀察到，在受到失血性休克及液體復蘇后PPAR-γ的表達相對于假手術組下降，在二次打擊后其表達相對于假手術組仍是降低的，但是和失血性休克及液體復蘇組沒有顯著性差異。在使用PPAR-γ的激動劑羅格列酮后，H-T組及D-T組中PPAR-γ的表達均得以升高，使用GW9662后H-T組及D-T組中PPAR-γ的表達均下降。

綜上所述，在二次打擊導致的MODS模型中，PPAR-γ在MODS發展過程中均能被其激動劑或拮抗劑所作用，但是PPAR-γ在發展過程中是否能夠起到相應的阻斷炎癥反應的作用，是我們下一步所要重點關注的。

[參考文獻]

[1] 喬萬海，屈莉，師猛，等. MODS大鼠外周血中PPARγ與TNF-α和IL-10動態變化的研究[J]. 第四軍醫大學學報，2009，30（8）：690-693.

[2] Andreas. Lenz，Glen.A. Franklin and WilliamG. Cheadle，Systemic inflammation after trauma [J]. Injury 2007，38（10）：1336-1345.

[3] Elizabeth A. Sailhamer，Yongqing Li，Eleanor J. Smith et al. Acetylation：a novel method for modulation of the immune response following trauma/hemorrhage and inflammatory second hit in animals and humans[J]. Surgery，2008，144（8），204-216.

[4] Lajos Széles，Dániel T■r■csik，László Nagy. PPARγ in immunity and inflammation：cell types and diseases[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Molecular and Cell Biology of Lipids，2007，1771（8），1014-1030.

[5] 喬萬海，王靜，師猛. 羅格列酮對脂多糖誘導的多器官功能障礙綜合征大鼠保護作用的研究[J]. 中國急救醫學，2007，27（6）：550-552.

（收稿日期：2012-10-30）