類風濕關節炎患者血清中納米細菌檢測及鑒定

[摘要] 目的 探討類風濕關節炎患者和正常人群血清標本中納米細菌分布情況。 方法 對30例正常人群和30例類風濕關節炎患者血清進行納米細菌培養，用鈣染色技術對培養物進行納米細菌檢測，采用間接免疫熒光法進行納米細菌鑒定。 結果 30例正常人和30例類風濕關節炎患者血清納米細菌的檢出率分別為6.7%（2株）、30.0%（9株），兩者間差異有統計學意義（χ2=2.919，P = 0.02 < 0.05）。 結論 類風濕關節炎患者血清中存在納米細菌，提示納米細菌感染與類風濕關節炎發病可能有關。

[關鍵詞] 類風濕關節炎；納米細菌；間接免疫熒光染色；血清

[中圖分類號] R593.22 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）02-0085-02

類風濕性關節炎是一種關節滑膜組織增生、炎癥細胞集聚、關節軟骨退變等病理特征慢性關節疾病，主要由炎癥細胞及炎癥因子介導。一直以來對類風濕性關節炎病因的探討大多圍繞自身免疫反應和微生物感染因素進行。1990年芬蘭科學家Kajander發現一種直徑較小、可以通過100 nm濾菌器的細小微粒，認為這種微粒是一種新型原核微生物，命名為Nanobaeteria[1]。本實驗中我們采用鈣染色法和間接免疫熒光法研究類風濕關節炎患者和正常人群血清中納米細菌的感染情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年1月1日～2011年12月31日我院骨關節科30例類風濕關節炎患者血清30份和門診30例正常人血清30份，男28例，女32例，年齡30～68歲，平均46歲。

1.2 儀器與試劑

Axiostar plus購自德國蔡司有限公司，Thermo FomaCO2孵育箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司，RPMI1640細胞培養基和γ射線照射過的胎牛血清購自GIBCO公司，FITC標記山羊抗小鼠IgG購自北京華夏遠洋科技有限公司，鼠抗納米細菌單克隆抗體購自芬蘭Nanobac OY公司。

1.3 方法

1.3.1 標本培養 將待測血清標本通過0.22 μm 和0.45 μm無菌濾菌器，制備成納米細菌菌懸液。 將0.1 mL菌懸液注入含10% γ射線照射過的胎牛血清RPMI1640培養基瓶中，37℃和5%CO2條件下孵育4周。將10% γ射線照射過的胎牛血清RPMI1640培養液加入生理鹽水作陰性對照，每周觀察并記錄生長情況。

1.3.2 茜素紅鈣染色 ①將血清標本培養菌液滴至載玻片上，自然晾干，用95%乙醇和乙醚固定15 min， 無菌水洗后70℃烤箱中10 min。②無菌蒸餾水沖洗3遍，每遍2 min。③用2%茜素紅鈣染液染4～5 min。④無菌蒸餾水速洗。⑤0.2%淡綠水溶液復染20～30 s。⑥0.5 %醋酸水溶液速洗。⑦用95%乙醇和100%乙醇脫水。⑧待烘干后用二甲苯透明中性樹膠封固，油鏡觀察。

1.3.3 間接免疫熒光法鑒定（IIFS） ①將血清標本培養菌液滴至載玻片上，自然晾干，用95%乙醇和乙醚固定15 min，無菌蒸餾水洗后70℃烤箱中10 min。②無菌蒸餾水沖洗3遍，每遍2 min。③滴加一抗鼠抗納米細菌單克隆抗體8D10，37℃孵育60 min，PBS沖洗3次，每次2 min。④加入FITC標記山羊抗小鼠IgG，37℃孵育40 min，用PBS再次沖洗3次，每次2 min。⑤80%甘油封片，置于熒光顯微鏡Axiostar plus下觀察。PBS替代鼠抗納米細菌單克隆抗體8D10作為陰性對照。

1.4 統計學分析

采用SPSS13.0軟件，計數資料采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

本研究60例血清標本培養4周后肉眼可見有11瓶培養液輕度混濁，可見灰白色顆粒狀沉淀出現，最大者直徑約0.3 mm。許多白色結晶顆粒粘附瓶壁。見圖1。納米細菌茜素紅鈣染色：普通光鏡下可見納米細菌的礦化外殼被茜素紅染成紅色，視野中布滿了紅色小顆粒，見圖2。間接免疫熒光法染色：納米細菌與單克隆抗體8D10抗體產生特異性結合見圖3，圖3可見綠色熒光的納米細菌。陰性對照未見綠色熒光物質。類風濕關節炎患者和正常人群之間血清中納米細菌檢測結果比較：30例正常人的血清中有2例納米細菌感染，其陽性率為6.7%；30例類風濕關節炎患者血清中有9例納米細菌感染，其陽性率為30.0%，差異有統計學意義（P < 0.05），說明類風濕關節炎患者血清中存在著納米細菌感染。見表1。

3 討論

納米細菌革蘭染色陰性球桿菌，可以通過0.22 μm濾菌器，直徑為50～500 nm。納米細菌可在PRMI1640和DMEM培養基中生長，生長環境以條件5%CO2和95%空氣為最佳。納米細菌可聚集于哺乳細胞周圍并被其吞噬，產生細胞毒性作用。納米細菌具有獨特的礦化能力，可在pH7.4及生理性鈣、磷濃度中形成石碳酸鹽結晶，從而可以形成礦化堅硬外殼覆蓋菌體周圍，形成所謂生物膜[2]。

國內外學者在人體許多疾病組織中檢測到納米細菌，納米細菌在人群中有較高感染率。陳亮等[3]報道24例腎結石患者血清標本中分離出22例納米細菌。Kumon H等[4]研究尿路結石與納米細菌的關系中，日本和巴拉圭人尿路結石樣本納米細菌檢出率分別為61.7%和66.7%。納米細菌可能與胎盤鈣化有密切關系，Guo Y等[5]報道納米細菌在鈣化胎盤中被檢到。Zeng J等[6]在牙髓結石中檢測到了納米細菌，研究表明納米細菌與牙髓鈣化也有密切關系。Candemir B等[7]研究發現在發病鈣化二尖瓣中檢測到納米細菌，可能在心血管動脈硬化和鈣化形成中起作用。

王學軍等[8]在部分健康人群血清納米細菌感染調查中發現，納米細菌感染率為5.7%。本研究正常人群血清中納米細菌檢出率為6.7%，與王學軍等的數據比較接近，研究顯示類風濕關節炎患者血清中納米細菌檢出率30%，遠大于正常人群血清中納米細菌檢出率6.7%，兩組間存在統計學意義（P < 0.05）。

實驗檢測類風濕關節炎患者血清中存在著納米細菌，表明納米細菌與類風濕關節炎發病有密切關系。2006年5月Tsuramoto等報道從2例膝骨關節炎和4例類風濕關節炎患者關節液中發現了納米細菌[9]，目前國內尚無相關報道。納米細菌引起類風濕關節炎的致病機制還需要進一步的研究，同時為臨床治療類風濕關節炎提供了新的方向。

[參考文獻]

[1] Kajander EO，Ciftcioglu N，Aho K，et al. Characteristics of nanobacteria and their possible role in stone formation[J]. Urol Res，2003，31（2）：47-54.

[2] Cisar JO，Xu DQ，Thompson J，et al. An alternative interpretation of nano bacteria-induced biomineralization[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97 （21）：11511-11515.

[3] 陳亮，黃曉波，許清泉，等. 腎結石患者血清中納米細菌的培養和形態學研究[J]. 北京大學學報，2010，42（4）：443-446.

[4] Kumon H，Matsumoto A，Uehara S，et al. Detection and isolation of nanobacteria-like particles from urinary stones：long-withheld data[J]. Int J Urol，2011，18（6）：458-465.

[5] Guo Y，Zhang D，Lu H，et al. Association between calcifying nanoparticles and placental calcification[J]. Int J Nanomedicine，2012，7：1679-1686.

[6] Zeng J，Yang F，Zhang W，et al. Association between dental pulp stones and calcifying nanoparticles[J]. Int J Nanomedicine，2011，7（6）：109-118.

[7] Candemir B，Ertas FS，Kaya CT，et al. Association between antibodies against calcifying nanoparticles and mitral annular calcification[J]. J Heart Valve Dis，2010，19（6）：745-752.

[8] 王學軍，劉威，楊竹林，等. 部分健康成年人群中血清納米細菌感染的調查[J]. 中華流行病學雜志，2004，25（6）：492-494.

[9] Tsurumoto T，Matsumoto T，Yonekura A，et al. Nanobacteria-like particles in human arthritic synovial fluids[J]. J Proteome Res，2006，5（5）：1276-1278.

（收稿日期：2012-08-02）