植塊法原代培養(yǎng)人衰老皮膚成纖維細(xì)胞

[摘要]目的：探索和建立人衰老皮膚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)的方法，為其在醫(yī)學(xué)美容抗衰老研究中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法：植塊法原代培養(yǎng)人衰老皮膚成纖維細(xì)胞；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)；HE染色觀察細(xì)胞的形態(tài)及著色情況。結(jié)果：用植塊法培養(yǎng)的人衰老皮膚成纖維細(xì)胞在顯微鏡下呈長梭形，有突起，平行、放射狀或漩渦狀排列。結(jié)論：確立了人衰老皮膚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)的方法，使其可供于延緩皮膚衰老的實驗研究。

[關(guān)鍵詞]人；衰老；皮膚；成纖維細(xì)胞；植塊法細(xì)胞培養(yǎng)

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0057-03

Explanted culture of aged human skin fibroblasts

CONG Jing1，SU Qiu-xiang1，GUO Li1，ZHANG Yong1，XIE Hui1，WANG Shuang-xun2，WU Jing-dong2，ZHOU Yang3

（1.Shenyang Medical College， Shenyang 110034，Liaoning，China； 2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110031，Liaoning，China； 3.The Fifth People's Hospital of Shenyang， Shenyang 110023，Liaoning，China）

Abstract： Objective To investigate a method for primary culture of aged human skin fibroblasts in vitro and to provide a reliable basis for researches of delaying skin aging. Methods Fibroblasts were cultured with explanted culture method. The morphology of fibroblasts were observed under inverted phase-contrast microscope and light microscope stained by HE. Results Aged human skin fibroblasts were obtained. Cells are long spindle in shape arranged in parallel or radiate or swirl way under microscope. Conclusions The method for primary culture aged human skin fibroblast in vitro is found. This study provides an efficient technique for delaying skin aging research.

Key words： human； aged skin； fibroblasts； explanted culture method

人皮膚成纖維細(xì)胞是皮膚真皮層中最主要的細(xì)胞成分，能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化，對真皮正常組織結(jié)構(gòu)和功能的維持和修復(fù)具有重要作用。皮膚衰老的多種臨床表現(xiàn)均與成纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的異常有關(guān)。目前許多研究顯示[1-3]，正常皮膚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)比較成熟，且應(yīng)用廣泛，但多取材于年輕幼稚的，甚至是胚胎時期的皮膚。關(guān)于體外培養(yǎng)人衰老皮膚的成纖維細(xì)胞的相關(guān)報道較少。本實驗擬通過對衰老皮膚成纖維細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)，探索體外培養(yǎng)衰老的成纖維細(xì)胞的方法及相關(guān)影響因素，在細(xì)胞水平上對衰老皮膚成纖維細(xì)胞的形態(tài)及生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為研究成纖維細(xì)胞在皮膚衰老過程中的作用機制提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及主要試劑：皮膚標(biāo)本10例，均取自施行眼袋切除術(shù)和倒睫矯正術(shù)的中老年女性眼瞼周圍的皮膚，年齡45～60歲，由中國醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院眼科和遼寧中醫(yī)藥大學(xué)美容科提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，美國GIBCO公司；胰蛋白酶，美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離表皮和真皮：用含雙抗的D-Hanks液（青霉素100KU/L、鏈霉素100mg/L）洗凈皮片，剪去皮下組織。洗必泰浸泡皮片8min，D-Hanks液清洗3次。將皮片剪成0.5cm寬的皮條，置于0.25%胰蛋白酶溶液中，于37℃下消化20min。更換新的胰蛋白酶溶液繼續(xù)消化，反復(fù)5次，最后4℃消化18h或過夜。將消化后的皮條轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中，揭去表皮，D-Hanks液清洗真皮片，用眼科剪將真皮片剪成1mm3的小塊。

1.2.2 植塊法原代培養(yǎng)：用吸管將組織小塊轉(zhuǎn)移至含有1ml D-Hanks液的離心管中，待其慢慢下沉，棄上清液，如此漂洗2次。用1ml培養(yǎng)液把培養(yǎng)瓶的生長面鋪滿。彎頭吸管吸取若干小塊，擺在生長面上，小塊相互距離0.5cm。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令生長面向上，37℃培養(yǎng)2～4h，使小塊微干涸。取出培養(yǎng)瓶，吸出剩余液體和未貼附的小塊，注入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液1～2ml，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋組織小塊。置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18～24h。待小塊固定牢固或細(xì)胞從組織塊爬出數(shù)量增多后，再補液至5ml。3～4天換液1次。

1.2.3成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：成纖維細(xì)胞從組織塊邊緣長出，達(dá)到約80%亞匯合狀態(tài)時，按1：2傳代培養(yǎng)。吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液，輕輕將組織塊吹打脫落，扔掉培養(yǎng)液及組織塊。用0.25%胰蛋白酶消化生長面上的細(xì)胞。鏡下見細(xì)胞回縮變圓、細(xì)胞間隙增大時，終止消化。反復(fù)吹打，形成細(xì)胞懸液。根據(jù)實驗需要調(diào)整細(xì)胞密度，移入新培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4天換液1次。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞：培養(yǎng)3天后，組織塊貼壁，邊緣游離出少量細(xì)胞。細(xì)胞為扁平或不規(guī)則三角形；組織塊間也可見少量散在或成堆分布的球形細(xì)胞。5天后，可見組織塊邊緣長出少部分細(xì)胞，呈梭形，放射狀排列。球形細(xì)胞減少，有的變?yōu)殄F體形。14天后，所有貼壁的組織塊邊緣均有細(xì)胞爬出。細(xì)胞呈細(xì)長梭形，有突起，放射狀生長，越向遠(yuǎn)端，體積越大。但組織塊間仍有間隙。經(jīng)過3～4 次傳代獲得純化的成纖維細(xì)胞（圖1）。

2.1 HE染色觀察成纖維細(xì)胞：細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀生長，細(xì)胞界限清楚。細(xì)胞核較大，圓形或橢圓形，藍(lán)色；胞質(zhì)豐富，紫藍(lán)色。當(dāng)細(xì)胞密度較大時，細(xì)胞體積較小，為梭形或不規(guī)則多邊形；細(xì)胞排列中等時，細(xì)胞體積較大，為細(xì)長梭形，常有2個細(xì)長突起；散在細(xì)胞體積大，不規(guī)則形，有多個細(xì)長突起（圖2）。

3 討論

細(xì)胞培養(yǎng)過程中的注意事項：①本次實驗選用的皮膚主要取自眼部外科手術(shù)，在運輸過程中，應(yīng)注意材料的無菌保存；離體的組織應(yīng)盡快處理，以免時間過長，影響細(xì)胞的活性[4]；為避免材料的污染，可在進(jìn)行消化前，用含雙抗的D-hanks液漂洗，洗必泰浸泡；②本實驗選用的是衰老的皮膚，組織細(xì)胞活性低；選用植塊法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，可以減少對組織細(xì)胞的損傷，保留更多有活性的細(xì)胞，提高細(xì)胞成活率；獲得的細(xì)胞大部分源自組織塊爬出，但也有少量來自胰蛋白酶消化下來的游離細(xì)胞貼壁；③皮膚成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)常用的消化酶是膠原酶；膠原酶可以特異性作用于結(jié)締組織的膠原，使其內(nèi)的細(xì)胞更容易遷出[5]；胰蛋白酶適合消化細(xì)胞間質(zhì)較少的組織，對細(xì)胞損傷較小[6]；也有報道[7]，將二者聯(lián)合使用，效果較好；本次實驗選用眼部皮膚，眼部皮膚的表皮層和皮下組織較薄，易于和真皮層分離；使用胰蛋白酶可以降低實驗成本；且多次更換新胰蛋白酶，既可以充分消化，又可以縮短消化時間，實驗結(jié)果比較理想；④成纖維細(xì)胞是真皮層和皮下組織中最主要的細(xì)胞成分，具有較強的分裂增殖能力，適應(yīng)性強，常常是細(xì)胞培養(yǎng)中的優(yōu)勢細(xì)胞；其次，本次實驗選材的特點，也使成纖維細(xì)胞成為本次細(xì)胞培養(yǎng)的主要細(xì)胞成分；再次，成纖維細(xì)胞消化脫壁快，在前幾次傳代時，細(xì)胞變圓即終止消化，只收集脫壁細(xì)胞，則利于純化；因此細(xì)胞培養(yǎng)至第3～4代時，即可得到較純的細(xì)胞；⑤成纖維細(xì)胞不僅易于培養(yǎng)，而且性狀穩(wěn)定，但本次實驗培養(yǎng)的是人衰老皮膚的成纖維細(xì)胞，細(xì)胞傳代后，細(xì)胞活力下降，生長速度減慢，老化細(xì)胞和凋亡細(xì)胞增多，且傳代次數(shù)越多，這種現(xiàn)象越明顯，傳代周期越長。

皮膚是人體最大的器官，且覆于體表，在人體衰老的過程中，皮膚衰老的臨床表現(xiàn)多樣而直觀。皮膚衰老容易引起人們的關(guān)注，產(chǎn)生較大的社會心理影響，因此關(guān)于皮膚衰老的研究在醫(yī)學(xué)美容中具有重要意義。成纖維細(xì)胞能合成分泌膠原蛋白、彈性蛋白和多種細(xì)胞因子[8]。膠原蛋白具有高度機械穩(wěn)定性，是維持皮膚張力和承受拉力的重要成分，也是維持皮膚飽滿充盈的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。皮膚老化松弛、干燥粗糙、彈性下降以及皺紋增多等表現(xiàn)均與成纖維細(xì)胞數(shù)量減少、功能障礙有關(guān)。本實驗在以往分離培養(yǎng)正常皮膚成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上，探索培養(yǎng)衰老皮膚成纖維細(xì)胞的實驗技術(shù)，為進(jìn)一步的實驗研究奠定基礎(chǔ)。今后在探索實驗條件和培養(yǎng)方法的改進(jìn)，培養(yǎng)過程中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變以及成纖維細(xì)胞在皮膚衰老過程中的影響等方面，可以開展更深入的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Carre AL， James AW， MacLeod L，et al. Interaction of Wingless Protein （Wnt），Transforming Growth Factor-1and hyaluronan production in fetal and postnatal fibroblasts[J].Plast Reconstr Surg，2010，125（1）：74-88.

[2]劉柳，李武德，蔡國斌.人胚胎成纖維細(xì)胞作為組織工程皮膚種子細(xì)胞的可行性研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2011，20（4）：605-608.

[3]劉垠，劉流，王繼華，等.長波紫外線照射皮膚成纖維細(xì)胞表皮生長因子受體的表達(dá)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（11）：1965-1968.

[4]Sidhu KS， Lie KH， Tuch BE. Transgenic Human Fetal Fibroblasts as Feeder Layer for human Embryonic Stem Cell Lineage Selection[J].Stem Cells Dev，2006，15：741-747.

[5]劉愛軍，靳俊峰.人皮膚成纖維細(xì)胞的高效分離培養(yǎng)及鑒定[J].廣東醫(yī)學(xué)，2008，29（12）：1969-1970.

[6]楊斌，洪清琦，徐令，等.組織工程皮膚種子細(xì)胞的同期快速分離[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2006，20（7）：754-757.

[7]辛毅，譚志敏，劉小慧.犬皮膚成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定[J].中國實驗動物學(xué)報，2010，18（6）：480-483.

[8]Zheng J， Huang XY， Wei X.A study on the promoting effects of recombinant human epidermal growth factor on skin wound healing in rats[J].Chin J Plastic Surg，2005，5（21）：379-383.

[9]Lamme EN，Van-Leeuwen RT，Mekkes JR，et al. Allogeneic fibroblasts in dermal substitutes induce inflammation and scar formation[J].Wound Repair Regen，2002，10（3）：152-160.