EdU體外標記人脂肪干細胞的實驗研究

[摘要]目的：體外培養人脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）并行EdU標記，并通過測試標記率及標記后對細胞增殖分化的影響確定優化的標記時間及濃度組合。方法：使用分別采5μM，10μM，20μM，50μM的濃度及12h，24h進行標記標記ADSC，并以流式細胞儀精確測定標記率。挑選出各12h及24h時優化標記濃度，并進行標記后測定細胞活性，增殖及誘導分化實驗。結果：P3代細胞約90%以上表達表面標記CD90+，CD105+，CD44+。基本不表達細胞表面標記CD45+，CD35+。通過各試驗，得出最適濃度組合10μM，12h，對進一步研究脂肪干細胞在輔助脂肪移植中的作用具有指導意義。結論：EdU是標記方法簡單有效，體外最佳標記濃度組合是10μM，12h。

[關鍵詞]脂肪干細胞；細胞治療；EdU；干細胞標記；細胞示蹤

[中圖分類號]R622 Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0043-05

Experimental study on the effect of labeling adipose derived stem cells with EdU

ZHANG Yi，WANG Ke-ming，LI Fa-cheng，WANG Shu-jie，LI Tai-ying，LIU Xin-hai，LIU Mei-chen，ZHAO Xiao-hui，MA Ji-guang

（Special Medical Department，Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100144，China）

Abstract： Objectives To establish the best method and optimal concentrantion and optimal time for labeling ADSC with thymidine analog，5-ethynyl-2-deoxyuridine（EdU）. Methods ADSC at passage 2～4 were labeled with EdU by diverse concentration （5μM，10μM，20μM，50μM）and diverse time（12h，24h）.After labeled， the cell were stained by ALEXA-555 analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometer.The impact of EdU on the growth of ADSCs was examined by trypan blue exclusion，methylthiazoly tetrazoliμM（MTT） assay and assess multiple differentiation potential of ADSC using in vitro osteogenic and adipogenic induction. Results Labeling with EdU in vitro can be easily performed，And labeling stem cells with the concentration of 10μM with 12h is the optimal concentration and time. The optimal concentration and time of labeling has little impact on the growth of ADSC or on the differentiation and can therefore be used for ADSC trading. Conclusion The lebeling method with EdU is simple but efficacious，and the optimal group is labeling with the concentration of 10μM and the time with 12h.

Key words：adipose-derived stem cells；cell therapy； EdU；stem cell labeling；cell tracing

人脂肪干細胞是存在于脂肪組織中的間充質干細胞，具有多向分化的潛能。脂肪干細胞來源廣泛且易獲取，在臨床上吸脂手術后廢棄的脂肪數量巨大，使用酶可以將脂肪干細胞分離出來[1-2]。脂肪干細胞應用廣泛，其促血管化能力強及具有內分泌功能的優點可使其廣泛用于細胞治療、基因治療、組織工程等，現已應用于臨床前期體內移植實驗[3-4]。為進一步研究干細胞移植后的療效及其原理，對干細胞行有效的標記就顯得尤為重要：通過示蹤的方法，可以直觀得了解移植細胞在體內存活、遷移、分布、增殖、分化、 轉歸，得到療效的評價及機制的推論。可以用來標記脂肪干細胞的標記物有跟多種，各有優缺點[6-7]。本實驗中探討的標記物EdU為新一代標記物，本質為核酸類似物，在細胞分裂增殖的過程中參與到核染色體中達到標記目的[8-9]。本實驗以EdU標記脂肪干細胞，使用流氏細胞儀精準檢測其標記效率及對標記后細胞行增殖分化能力的測定以獲得優化標記條件。

1 材料和方法

1.1主要試劑及藥品：低糖DMEM培養基（葡萄糖 1000mg/L，谷氨酞胺4mM/L，HyClone公司，美國），特級胎牛血清（FBS，GIBICO公司，美國），0.25%胰蛋白酶（HyClone公司，美國），平衡鹽溶液（磷酸鹽緩沖液，Phosphatebuffersolution，PBS，HyClone公司，美國），青霉素-鏈霉素溶液（PS，青霉素100U/ml，鏈霉素100ug/ml，Amresco 公司，美國），I型膠原酶 （Sigma公司 美國）二甲基亞礬（DMSO，Amresco 公司，美國），MTT（Sigma公司，美國），鼠抗人單克隆抗體CD45，CD90，CD105，CD44，CD34（購自eBioscience公司） EdU（Invitrogen公司 美國），油紅O，茜素紅（Sigma）。

1.2 ADSCs分離培養和傳代：人脂肪抽吸術中應用10ml注射器接2.0mm吸脂針，無菌狀態下將脂肪組織離心，去上層脂肪組織，加入終濃度為0.075%的I型膠原酶。37℃恒溫箱，震蕩消化40min。收集最下層細胞沉淀。1ml完全培養基重懸細胞。加入3ml紅細胞裂解液并輕輕漩渦顛倒均勻，置于冰上15min，其間輕輕漩渦均勻混懸兩次。并將其置于直徑為6cm的中皿內。將培養皿置入體積分數為5%CO2、飽和濕度37℃培養。待細胞貼壁后更換培養液，去掉非貼壁細胞，更換新培養液。以后每3天更換細胞培養液1次。每日在相差倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況。原代細胞培養7天即可融合傳代。

1.3 流式細胞儀檢測細胞表型：取第3代ADSC制成單細胞懸液，進行分裝并行抗體標記，每份不少于1×106細胞。室溫下以CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC、CD44-PE、CD34-PE抗體標記，IgG-FITC，IgG-PE為同型對照，不標記細胞為空白對照。入流式細胞儀檢測細胞表面標記物。

1.4 EdU標記及染色：使用第3代細胞作為實驗細胞。在細胞狀態良好時加入EdU并孵育至合適時間，去除EdU，PBS洗凈背景。

對于固定細胞的染色及檢測：使用96孔板以EdU標記細胞后固定染色。含3.7% 甲醛的PBS固定。并以含0.5% TritonR X-100的PBS破膜，加入染色反應液click-iTR，避光、室溫、脫色搖床孵育30min。其中取各實驗組混合細胞作為對照不染ALEXA-555染料。除去染色反應液后，加入背景核染料Hoechst，避光、室溫、脫色搖床孵育30min。PBS清洗3次，4℃保存。熒光顯微鏡觀察。

對于單細胞懸液的染色及檢測：將標記后細胞收集起來并制成單細胞懸液。取未標記EdU細胞作為陰性對照，并取各實驗組混合細胞作為對照，不染ALEXA-555染料。通過流式細胞儀檢測表達率反應EdU在ADSC的標記率。

1.5 測定EdU對ADSC活性及影響其增殖及分化的程度：根據實驗結果，分別選擇在12h，24h 時優化標記濃度即10μM，12h；5μM，24h。進行細胞活性及增殖分化檢測。以0μM，0h作為空白對照，分別行臺盼藍排斥實驗，MTT比色實驗和成脂成骨定向分化實驗對細胞活性進行測定。定向誘導分化完成后行茜素紅染色及油紅O染色觀察。染色后以倒置顯微鏡觀察鈣結節及脂滴生成情況，100倍視野下，分別隨即選取5個高倍視野進行計算，計算鈣結節及脂滴的個數。多組間比較采用重復測量資料的方差分析，標記率最高組與其余組比較采用Dunnett-t檢驗進行統計學分析，統計軟件采用SPSS 20.0分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADSC細胞形態：倒置相差顯微鏡下觀察：原代ADSCs 24h 后即可觀察到少量貼壁細胞，顯微鏡下細胞呈小多角形、大小不一，細胞散在分布，量較少（見圖1），3天后可見大部分ADSCs貼壁（見圖2）。更換培養液繼續培養。原代培養細胞一般7天可達80%～90%融合，單個細胞呈短梭形，核呈橢圓形，核仁清晰，細胞形態較一致、整體呈集落樣生長，（見圖3）行傳代培養。原代細胞傳代后細胞增殖速度加快，一般2～3 天即可達80%融合狀態，可再次傳代（見圖4），傳代細胞單個細胞呈短梭形，細胞形態較一致，呈一定方向性類成纖維細胞樣形態。P3代細胞，細胞排列較整齊，體積較原代稍大。細胞呈一定順序生長，排列整齊，高倍鏡下立體感強（見圖5）

2.2 人ADSC細胞表型測定結果：P3代細胞約90%以上表達表面標記CD90+，CD105+，CD44+。基本不表達細胞表面標記CD45+，CD35+。各表面標記表達率表示P3代細胞基本純化。

2.3標記后熒光顯微鏡觀察及不同濃度下脂肪干細胞的標記率：細胞活性好時加入EdU，圖上可見新分裂的細胞呈圓形，尚未貼壁生長。加入EdU孵育一定時間后固定染色，以ALEXA-555染色并以Hoechst染背景細胞。觀察時，在不轉換視野的情況下分別以綠色熒光和紫外熒光激發待檢細胞。可見被EdU染色的細胞核為紅色，而全部細胞核為藍色。將二者重疊可見藕荷色被標記細胞。其顏色深淺可反應染色體中EdU的參與量大小（見圖6A、6B、6C）。

單細胞懸液染色后經流式細胞儀檢測，結果顯示在12h，24h時0μM，5μM，10μM，20μM，50μM濃度的標記率如表1。

2.4 EdU對ADSC活性及影響其增殖及分化的程度

2.4.1 臺盼藍試驗：各實驗組結果比例占總細胞數97%以上，經統計學分析后各數據無統計學差異（圖7）。

2.4.2 MTT比色實驗：將EdU去除后繼續行細胞培養，比較標記后的細胞活性大小，每間隔24h行檢測一次，根據酶聯免疫檢測儀測定結果，根據顯色結果繪制細胞生長曲線。可見相同時間內，未標記組細胞量大，以10μM，12h組標記的細胞較5μM， 24h組標記的細胞量大，但都小于未標記組（圖8）。

2.4.3成脂分化和油紅O染色：在誘導培養過程中，可觀察到細胞中小脂滴逐漸融合形成大的脂滴，將細胞核擠向一側。脂肪分化誘導6天后開始觀察到透亮的小脂滴出現，在2周后達到高峰， ADSC油紅O染色陽性，油紅O染色后細胞內出現大量紅染顆粒，誘導2周后成脂分化比例為30%～40%。空白未加誘導液組始終未觀察到脂滴的出現。未標記EdU組、以10μM，12h標記組及以5μM，24h標記組出現脂滴數據行統計學分析每兩組間行t檢驗，可見結果如下：其中，5μM，24h標記組與另兩組P<0.05，有統計學差異（圖9、11）。

2.4.4成骨分化和茜素紅染色：成骨誘導的第5天開始，在相差顯微鏡下可觀察到一些ADSC形態由梭形轉變為立方狀或多角形，體積增大。在誘導的第l0天左右開始出現小的點狀鈣化斑，在誘導的第14～28天，茜素紅染色可見著紅色的典型鈣化結節。空白未加誘導液組形態仍為成纖維細胞樣，細胞大小基本不變，偶也可見圓形或多角形細胞，茜素紅染色均不著色或極弱。未標記EdU組、以10μM，12h標記組及以5μM，24h標記組出現脂滴數據行統計學分析每兩組間行t檢驗，可見結果如下：其中，10μM，12h標記組與另兩組P>0.05，無統計學差異。5μM，24h標記組與另兩組P<0.05，有統計學差異（圖10、12）。

綜合以上實驗結果，推斷使用EdU標記人脂肪干細胞時，以10μM的濃度標記12h為優化的標記方式。

3 討論

3.1 EdU（5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物[10]，其連有的炔烴基團在自然化合物中很少見，能夠在DNA復制S期時代替胸腺嘧啶（T）滲入正在合成的DNA分子中，最早合成被用作核苷類似物類抗菌藥物[11-13]，近年來，越來越多的被用來檢測DNA復制及細胞增殖。EdU參與增殖時插入到正在復制的DNA分子中，可被顯色劑與EdU發生共軛反應而檢測新合成的DNA[14-15]。與傳統的免疫熒光染色（BrdU）檢測方法相比，更為方便且對細胞影響小[16-17]。所以，本實驗預通過對EdU標記ADSC的研究，探求優化標記濃度及標記時間，成為示蹤劑追蹤移植入體內的ADSC，觀察其轉歸。

3.2 EdU是核標記物，相當于探針在細胞分裂時參與DNA的合成而進入細胞[14-15]。標記整個細胞的過程與細胞增殖活性有關，而染色率與細胞活性有關，活性高者細胞分裂增殖快，相同時間內染色率高，活性低者或細胞量多進入平臺期者細胞分裂增殖慢，相同時間內染色率低[18-19]。故選取狀態優良且為對數期的細胞進行標記。標記時間選取細胞倍增時間，濃度則需要多次嘗試。過高的濃度或過長的時間將導致狀態不良的細胞死亡。

3.3 EdU標記方法的探討：理想的細胞標記物除標記率高外，需對細胞的增殖分化也無影響。雖然EdU分子量小，對細胞影響較小，但高濃度或長時間標記會影響細胞的代謝及增殖分化。EdU是新一代細胞核標記物，用DMSO或去離子水溶解為儲存液時，二者的標記性質發生了改變，以DMSO溶解者，染料標記細胞核時擴散作用明顯，可以提高細胞標記率。但DMSO將影響細胞的增殖分化及體內過程。而以去離子水溶解者，染色后對細胞活性影響較小，但是影響其標記率，需要通過增加標記時間或濃度提高標記率[20]。

標記時，將傳代的細胞孵育過夜后再行細胞標記，配置2倍濃度的EdU待用，去除一半培養基后將2倍濃度的培養基加入培養皿中孵育。使細胞保持局部微環境使其影響變小。也有助于EdU在培養基中混合均勻。

一些細胞在標記后形態有所改變，細胞變寬，變大，核染色較深。其原因可能與有機溶劑DMSO有關，DMSO是在低溫凍存下細胞穿透性的保護劑，常溫下有機溶劑具有細胞毒作用。隨標記濃度的增加，細胞形態改變也逐漸明顯，甚至細胞死亡數量增加，在這些可能與DMSO濃度增加有關。這也與國外報道的DMSO具有細胞毒作用，且濃度及時間依賴性相一致。

3.4 EdU對細胞損害原因探討：在流式細胞檢測過程中，相同細胞量細胞經過不同濃度的EdU染色相同時間后從培養皿上消化下來制成單細胞懸液進行檢測，可發現細胞量有變化，濃度高者細胞量少，證明經染色后細胞有部分死亡現象。其死亡率與染色濃度成正比。分析其原因可能為：①染料對細胞的毒性作用；②有機溶劑對細胞的毒性作用；③因培養皿上細胞的濃度不同，使細胞消化，離心的操作對細胞的損耗不一。

3.5 對ADSC的討論： EdU標記的原理是作為核苷類似物在細胞增殖時參與到新合成細胞的染色體內標記細胞。在體內反應微弱的遷移增殖變化時，效果最優，在研究組織器官的動力學方面效果優于其他染料。目前對干細胞定義的理論眾說不一[21-22]，酶消化法提取的ADSC中經傳代純化后的細胞里真正含有干細胞來源的細胞量較少。一些理論認為干細胞為性質較穩定的細胞，細胞長期處于靜止狀態，當受到信號刺激時才會增殖[22-23]。體外培養時，在一定的標記時間內當干細胞處于靜止狀態時，則被標記的細胞將不是干細胞性質的，研究單純的標記率也就失去了意義。

3.6 經EdU標記后的ADSC的增殖及轉化情況也很重要。經標記后的細胞最終要轉移到體內進行示蹤，理想的示蹤劑須對被標記細胞的增殖和分化無任何影響。但是活細胞的增殖及分化過程對外環境要求苛刻，容易受到外環境的影響。幾乎所有的示蹤劑都會干擾細胞正常的生理狀態，影響其增殖分化。我們通過降低細胞的標記濃度及標記時間，在較小的影響細胞增殖的情況下達到最大的標記率。我們行MTT實驗，以不標記的正常細胞作為對照，96孔板觀察細胞的增殖情況。得出在10μM及12h的標記組合時，其細胞增殖的曲線與對照組增殖的曲線較近。對細胞的影響較小，優于其他組細胞。在定向分化的比較中，得到相同結論，說明10μM時，不僅標記率高，且對細胞的影響也小，從而得到優化的標記率。體外狀態與體內狀態有不同程度的差異，今后，需要大量的實驗證實EdU標記的ADSC在體內的轉化過程，是否影響體內ADSC的代謝情況。并努力尋找對細胞活性影響更小的標記物。

4 結論

EdU標記方法簡單，需時間短，標記率高，作為探針標記精確，特異性強，適合干細胞的示蹤標記。臺盼藍排斥實驗，MTT實驗證實10μM，12h 和5μM，24h 組合標記的脂肪干細胞在影響細胞增殖方面無明顯差別。定向分化實驗證實了10μM，12h 組合標記方法對細胞分化影響較小。本實驗篩選出干細胞標記的優化標記濃度和標記時間組合即10μM，12h，且標記率能達到90%以上。為進一步測試體內細胞標記率奠定了基礎。

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