組織工程骨—軟骨復(fù)合組織體內(nèi)異位移植的研究

[摘要]目的：本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合組織并采用異體異位移植方式，探討外來因素對(duì)移植物的影響，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。方法：制備明膠-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸及明膠-陶瓷化骨多孔復(fù)合支架，復(fù)合軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將上述組織按照體外培養(yǎng)時(shí)間不同分為4組，植入裸鼠皮下，觀察復(fù)合組織形成情況。結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組在觀察期內(nèi)裸鼠背部均無感染，復(fù)合組織表面完整薄層纖維層下可見類似透明樣軟骨組織，體積均出現(xiàn)不同程度的收縮。HE染色各實(shí)驗(yàn)組均可發(fā)現(xiàn)，在軟骨層和骨層，分別可見成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)，且可以觀察到類似正常結(jié)構(gòu)的潮線出現(xiàn)，交界區(qū)軟骨組織出現(xiàn)骨化，在組織外圍，出現(xiàn)了不同程度向纖維樣組織轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象。結(jié)論：經(jīng)過體外短時(shí)間的誘導(dǎo)使得細(xì)胞具有分化趨勢后，早期植入體內(nèi)有助于組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的形成。

[關(guān)鍵詞]骨軟骨；組織工程；異位移植

[中圖分類號(hào)]R318 R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）01-0051-04

Study on heterotopic transplantation of tissue engineering osteochondral composites

DENG Tian-zheng，LV Jing，YANG Jie-fei，KE Jie

（Department of stomatology，Air Force General Hospital PLA，Beijing 100142，China）

Abstract： Objective To construct tissue engineering osteochondral composite tissue，and undergo allogeneic transplantation. Discusses the influence of the external factors on the graft， and establish the foundation for the further research. Methods Gelatin-chondroitin sulfate-hyaluronic acid-gelatin-ceramic osteochondral composites scaffolds were ontracted， and seeded with chondrocyte and bone mesenchymal stem cells. Transplanted subcutaneously into nude mice according to different time and then analyzed histogenesis after the operation. Results There was no infection on dorsum in each group during observation period. It could be seen hyaline cartilage like tissue on the surface of composite tissue surface. The volume appeared smaller than pre-operation. HE stain showed cartilage cells cells， osteocyte and extracellular matrix respectively in cartilage and bone layer.It also can be seen tide line similar as nature tissue. In junctional area cartilage appeared ossification， and in peripheral tissue it appeared fibrosis. Conclusion It can be concluded that after short time induced in vitro，the cells have differentiation trend， it will be benefit for forming osteochondral composite tissue.

Key words：osteochondral；tissue-engineering；heterotopic transplantation

構(gòu)建組織工程化骨-軟骨復(fù)合組織的臨床目的就是希望能夠在體內(nèi)形成有效的骨-軟骨組織，從而能夠發(fā)揮其應(yīng)有功能[1]。組織工程移植物在體內(nèi)形成組織有很多關(guān)鍵的影響因素，例如體外復(fù)合時(shí)間、方式、體內(nèi)植入時(shí)機(jī)、體外誘導(dǎo)因素、植入體內(nèi)部位、受床血供、周圍組織健康狀況、周圍組織支撐情況、受者免疫排斥等問題[2]。從目前文獻(xiàn)看大多數(shù)學(xué)者支持采用自體細(xì)胞原位移植，這樣可就最大程度避免了免疫排斥以及異位移植缺乏相應(yīng)的生長因子及功能刺激等因素[3]。但采用異體細(xì)胞異位移植更能說明移植物形成組織情況，本實(shí)驗(yàn)采用了異體異位移植方式，探討外來因素對(duì)移植物的影響，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料：2周齡新西蘭大白兔4只，雄性，體重0.4kg；6周齡裸鼠5只（由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。速眠新（軍科院獸研所 中國長春）、DMEM/F12低糖培養(yǎng)基（Gibco 美國）、胎牛血清（四季青 中國）、II型膠原酶（Gibco美國）、0.25%胰蛋白酶（Sigma美國）、地塞米松（Sigma 美國）、抗壞血酸（Sigma 美國）、β-甘油磷酸鈉（Sigma 美國）、明膠粉劑（Sigma，美國）、硫酸軟骨素粉劑（Sigma，美國）、透明質(zhì)酸鈉（正大福瑞達(dá)藥業(yè)公司，中國山東）、碳化二亞胺（EDC，Sigma，美國）、倒置顯微鏡及顯像系統(tǒng)（Olympus日本）、低溫高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）、BB16型CO2培養(yǎng)箱（Heraeus美國）、SW-CJ-1B型超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)），其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 種子細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：實(shí)驗(yàn)采用兔耳原代軟骨細(xì)胞和第三代成骨誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）為種子細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)方法參照我們前期實(shí)驗(yàn)[4]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：體外復(fù)合后根據(jù)共培養(yǎng)時(shí)間不同分為：1天組（A）、7天組（B）、14天組（C）、無細(xì)胞組（對(duì)照組D），每組4例，共16例。

1.2.3 骨軟骨復(fù)合支架制備：選一健康實(shí)驗(yàn)兔，處死后取出完整關(guān)節(jié)。以藻酸鹽印模材制取兔關(guān)節(jié)模型陰模數(shù)個(gè)，普通石膏灌制關(guān)節(jié)模型陽模后自凝塑料制備成具備兔關(guān)節(jié)外形的陰模。模型消毒后備用。新鮮小牛肋骨（北京市安定屠宰場）雕刻成類似關(guān)節(jié)外形，經(jīng)脫脂、脫蛋白，置于馬佛爐中緩慢加溫至800℃，持續(xù)3h后取出，冷卻后浸入37℃、0.5%明膠溶液30min，充分浸透后500r/min離心1min，作為骨層備用。參考fan等[5]的制備方法，以0.5g明膠粉劑、0.1g硫酸軟骨素粉劑和5mg透明質(zhì)酸鈉加入7ml三蒸水中，38℃下攪拌至溶解，并注入預(yù)先制備好的模具內(nèi)，作為軟骨層。待軟骨層完全結(jié)固前將骨層支架插入，插入深度小于1mm，室溫下冷卻后，放入-20℃冰箱過夜后行抽真空凍干。凍干后將復(fù)合支架浸入無水乙醇60min，再置入70%和50%乙醇中各30min，浸入50mmol/L碳化二亞胺的95%乙醇溶液中，室溫交聯(lián)24h。三蒸水超聲清洗3 遍后真空凍干。使用前修整骨層與軟骨層厚度，軟骨層約2mm，骨層不大于10mm。

1.2.4 復(fù)合細(xì)胞：將第三代誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化后以2×106/ml的密度接種于骨層，使支架完全被浸透而無溢出，37℃、5%CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)2h后，反轉(zhuǎn)材料，注入礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)，液平面位于雙層結(jié)構(gòu)連接處，此時(shí)將原代兔耳軟骨細(xì)胞消化后以5×107/ml的高密度同樣方法接種于軟骨層，2h后，將液平面提升到剛剛沒過支架處。三維培養(yǎng)2天后進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 體內(nèi)異位移植：復(fù)合后根據(jù)分組情況形裸鼠皮下移植并連續(xù)觀察8周，每只裸鼠根據(jù)體形大小植入2或4塊復(fù)合組織，所有組織在一天內(nèi)全部植入裸鼠體內(nèi)。

1.2.6 檢測指標(biāo)：組織植入后于第2、4和8周取材，取材時(shí)輕輕剝離表面纖維層，充分暴露其下方的移植組織，以4%多聚甲醛固定30min，放入脫鈣液內(nèi)避光脫鈣24h，取出后梯度脫水石蠟包埋。進(jìn)行大體觀察、HE染色。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察：各實(shí)驗(yàn)組在觀察期內(nèi)裸鼠背部均無感染或瘺管出現(xiàn)，分別在體內(nèi)培養(yǎng)2、4、8周時(shí)取材，形成的組織與裸鼠皮下周圍組織似形成潛在間隙因此可以輕松剝離，復(fù)合組織表面包被纖維組織，并可以觀察到脈管系統(tǒng)爬行于其表面（圖1、2），脈管系統(tǒng)隨體內(nèi)植入時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸密集趨勢；復(fù)合組織表面完整薄層纖維層下可見類似透明樣軟骨組織。觀察期內(nèi)各組組織三維形狀無明顯變化，但體積均出現(xiàn)不同程度的收縮，尤以C組最為顯著，說明材料在體內(nèi)出現(xiàn)降解或崩解。觀察發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組中組織收縮情況與組別有關(guān)，即隨體外復(fù)合時(shí)間延長體積收縮越大（表1）。對(duì)照組中無感染出現(xiàn)，移植物表面同樣可見纖維包裹并有脈管網(wǎng)形成，但部分區(qū)域可見外露支架，將表層纖維組織去除可觀察到支架結(jié)構(gòu)，支架吸收明顯，體積較實(shí)驗(yàn)各組變小。

2.2 組織學(xué)觀察：2周時(shí)HE染色見A組支架材料部分降解，殘余的材料間及周圍有大量的軟骨樣組織形成，細(xì)胞呈類圓形，胞核居中，基質(zhì)成分較多，可見軟骨陷窩，軟骨層內(nèi)內(nèi)無血管長入，中央?yún)^(qū)域可見軟骨團(tuán)對(duì)照組殘余材料間及材料周圍為纖維結(jié)締組織，在雙層組織過渡區(qū)可以觀察到少量軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞向?qū)Ψ浇M織支架內(nèi)爬行生長，呈相互嵌入式生長，且基本保持了自身的表型特點(diǎn)。這種生長方式有助于兩層組織間的結(jié)合，并形成類似與正常組織的結(jié)構(gòu)。由于脫礦過程中骨層支架材料溶解，而形成的細(xì)胞外基質(zhì)還不能足以保持組織形態(tài)，所以骨層組織呈現(xiàn)缺失狀態(tài)但在剩余組織材料間隙及周圍可見片狀骨組織，部分為未完全鈣化的軟骨組織，部分形成骨小梁， 可見新生的類血管樣管狀結(jié)構(gòu)（圖3）。B組、C組與A組接近，所形成的組織基質(zhì)較A組更明顯，但中心區(qū)域可見到少量無細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)，骨層可見散在片狀類骨樣組織。4周時(shí)A組的軟骨層支架大部分降解，為較成熟的軟骨組織替代；骨層支架亦部分降解，可見更多骨小梁結(jié)構(gòu)形成。兩部分交界處有部分殘余支架材料，新生的軟骨和骨組織部分為骨和軟骨直接連接（圖4）。B組、C組軟骨層表層逐漸向纖維組織改變，但深部區(qū)域仍為軟骨樣結(jié)構(gòu)，骨層支架部分降解，組織外緣逐漸被纖維組織包裹替代，骨軟骨結(jié)合處依然為骨和軟骨的直接連接，但并不完整。8周時(shí)A組復(fù)合體形成結(jié)合良好的骨-軟骨組織。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在軟骨層和骨層，分別可見成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)，且可以觀察到類似正常結(jié)構(gòu)的潮線出現(xiàn)，交界區(qū)軟骨組織出現(xiàn)骨化，在組織外圍，出現(xiàn)了向纖維樣組織轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象（圖5）。B組、C組可以觀察到更多的纖維組織形成，且纖維組織向復(fù)合組織內(nèi)部生長。對(duì)照組兩部分均可見殘余支架材料及纖維結(jié)締組織和新生血管。

3 討論

本研究構(gòu)建的組織工程骨-軟骨復(fù)合組織在體內(nèi)異位可形成骨-軟骨樣組織，這與其他一些學(xué)者的研究結(jié)果一致[6-8]。新形成的組織外層包被一層纖維組織，該現(xiàn)象說明本實(shí)驗(yàn)所用的移植物具有很好的生物相容性，更重要的是這一現(xiàn)象還提示移植物在體內(nèi)形成了具有其自身特點(diǎn)的組織，與所埋植的區(qū)域具有明顯不同的組織結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到良好的骨及軟骨層間的過渡區(qū)域，從組織學(xué)上觀察，可以明顯地觀察到兩層組織分界，類似正常組織分界。在骨與軟骨過渡區(qū)，可以觀察到至少三種形態(tài)的細(xì)胞，包括類似肥大軟骨細(xì)胞和軟骨前體細(xì)胞以及細(xì)胞形態(tài)更小的細(xì)胞，他們多數(shù)存在于軟骨或骨陷窩內(nèi)。且這一層的基質(zhì)分泌情況要比上方軟骨層明顯減少，組織間隙變大，這也與脫礦后形成的組織間隙有關(guān)。且過渡區(qū)軟骨組織邊緣的基質(zhì)有鈣化跡象，這可能與非關(guān)節(jié)環(huán)境下組織血供豐富有關(guān)。過渡區(qū)那些較小的細(xì)胞呈現(xiàn)多角形或不規(guī)則圓形，分析可能是一小部分受區(qū)BMSC滲透到支架內(nèi)部與軟骨細(xì)胞接觸并在軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)下向軟骨細(xì)胞分化，其他遠(yuǎn)離軟骨細(xì)胞的則向成骨細(xì)胞方向分化。也說明細(xì)胞間接觸誘導(dǎo)是確定的，不同細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及基質(zhì)確實(shí)參與了細(xì)胞誘導(dǎo)分化[9]。隨著體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組中軟骨層均出成纖維樣結(jié)構(gòu)，可能由于功能需要軟骨組織正逐漸形成纖維軟骨，如果繼續(xù)培養(yǎng)可能出現(xiàn)移植組織最終形成纖維組織[10]。而在關(guān)節(jié)環(huán)境下的成軟骨作用及對(duì)骨-軟骨缺損的修復(fù)效果，將是我們進(jìn)一步的研究內(nèi)容。

本實(shí)驗(yàn)中，A組體外復(fù)合培養(yǎng)時(shí)間最短，因此細(xì)胞大量黏附在支架孔隙表面，還沒有形成細(xì)胞外基質(zhì)，這樣就能夠保證植入體內(nèi)后營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物的交換，同時(shí)實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)組織形成過程中骨層內(nèi)部有管腔樣結(jié)構(gòu)形成，說明組織在形成過程中可能有血管長入骨層，這樣就為組織內(nèi)部的生長提供了代謝途徑，保證了組織內(nèi)外協(xié)調(diào)生長，不會(huì)因?yàn)榻M織內(nèi)部營養(yǎng)代謝問題導(dǎo)致內(nèi)部組織的壞死進(jìn)而發(fā)生更大面積的破壞甚至失敗。在軟骨層則沒有發(fā)現(xiàn)有管腔樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，這與正常軟骨組織相符，同樣也符合軟骨組織生長規(guī)律[11]。如果軟骨內(nèi)有血管長入那么軟骨層將逐漸出現(xiàn)纖維化，而且軟骨細(xì)胞存在于軟骨基質(zhì)內(nèi)，其營養(yǎng)供應(yīng)依靠滲透獲得，即處于一種缺氧狀態(tài)，如果血管長入將改變這種環(huán)境最終使得軟骨細(xì)胞去分化、表型喪失、功能喪失等[12]。

上述結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)也進(jìn)一步說明該支架是適合復(fù)合組織生長的。骨層由于孔隙較大，使得血管樣組織早期即能向組織內(nèi)部生長，而軟骨層孔隙小則不利于管腔樣組織的形成。同時(shí)，由于選用的細(xì)胞具有較強(qiáng)的分泌基質(zhì)能力，早期即可形成大量基質(zhì)因而進(jìn)一步阻塞了支架孔隙妨礙了管腔長入。而隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，隨著基質(zhì)分泌的增多特別是周邊細(xì)胞營養(yǎng)充分，細(xì)胞團(tuán)外基質(zhì)分泌較旺盛，就必然將支架孔隙封閉，細(xì)胞團(tuán)中心部位細(xì)胞由于營養(yǎng)彌散受限而易發(fā)生死亡，最終將導(dǎo)致支架內(nèi)部與外部組織形成的不一致，外部形成薄層組織而內(nèi)部則沒有，尤其是植入體內(nèi)后，很有可能因?yàn)橹Ъ軆?nèi)部尤其是骨層細(xì)胞缺乏營養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞無法長期存活發(fā)揮功能使得內(nèi)部形成空腔結(jié)構(gòu)使得組織塌陷等，也就無法滿足缺損區(qū)的修復(fù)要求。因此，可以認(rèn)為經(jīng)過體外短時(shí)間的誘導(dǎo)使得細(xì)胞具有分化趨勢后，早期植入體內(nèi)有助于組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的形成[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)形成的軟骨層通過大體觀察組織化學(xué)觀察和顯微熒光觀察都顯示出軟骨特點(diǎn)，同時(shí)形成的軟骨層厚度有2mm左右，而正常人股骨頭關(guān)節(jié)軟骨接近韌帶區(qū)厚度平均約2.8mm[15]，中間及外側(cè)區(qū)域軟骨厚度約1.1～1.3mm。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)A組4周時(shí)軟骨層厚度在降低，而在8周時(shí)軟骨層厚度反而增加，其他實(shí)驗(yàn)組則在8周內(nèi)軟骨層厚度在逐漸降低，說明A組中的軟骨在生長過程中具有與正常軟骨組織類似的形成方式，能夠不斷地分泌軟骨基質(zhì)來保持軟骨結(jié)構(gòu)的完整性，此外這可能也與體外復(fù)合時(shí)間長短有關(guān)。然而，異位培養(yǎng)時(shí)間增加，軟骨層厚度是能否增加還是或者吸收，是否導(dǎo)致軟骨表型逐漸喪失都將是需要進(jìn)一步闡明的問題。

作為骨-軟骨復(fù)合組織移植物最重要的就是功能恢復(fù)[16]。雖然天然組織的幾何形態(tài)尤其是過渡區(qū)的帶狀結(jié)構(gòu)并沒有在所構(gòu)建的移植物中明確出現(xiàn)，但觀察到很多類似天然結(jié)構(gòu)的一些特征性結(jié)構(gòu)仍然出現(xiàn)在軟骨層，例如軟骨陷窩、細(xì)胞分層排列、細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)形成以及特有的圓形細(xì)胞形態(tài)等。事實(shí)上很多報(bào)道稱體外形成的骨-軟骨復(fù)合組織植入體內(nèi)后可以最終改建成與正常軟骨結(jié)構(gòu)一樣的帶狀拱形結(jié)構(gòu)的透明軟骨[17-18]。因此可以推測，在體內(nèi)機(jī)械應(yīng)力和生物誘導(dǎo)條件下組織工程組織可以改建并最終與機(jī)體相適應(yīng)。

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