斑點雜交法檢測正畸大鼠三叉神經節PPTAmRNA的變化

[摘要]目的：觀察正畸牙齒移動不同時期大鼠三叉神經節（Trigeminal Ganglion ，TG）中前速激肽原A（PPTA）mRNA的表達變化，初步探討牙齒移動導致疼痛的可能機制。方法：采用斑點雜交的方法檢測正畸加力后不同時期大鼠TG內PPTAmRNA水平的變化情況。結果：加力2h大鼠三叉神經節PPTA mRNA的表達量開始增加，加力8h至加力3天達到最高，至第7天 PPTA mRNA水平仍然明顯高于對照組。結論：正畸牙齒移動能導致TG內PPTAmRNA表達水平的上調，提示PPTA可能參與了正畸疼痛的發生。

[關鍵詞]P物質；前速激肽原A（PPTA）；牙齒移動；正畸疼痛；三叉神經節（TG）；斑點雜交

[中圖分類號]R332 R783.5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0067-02

Changes in the Expression of PPTA mRNA in the Rat trigeminal Ganglion during Tooth Movement using Dot-blot hybridization method

YIN Yue，SUN Ying-ming

（1.Anhui Medical University，School of Stomatology，Hefei 230032，Anhui，China； 2.Department of People's Liberation Army 101 Hospital Dental，Wuxi 214044，Jiangsu，China）

Abstract： Objectives To investigate the changes in the Expression of PPTA mRNA in the Rat trigeminal Ganglion during Tooth Movement. Methods The changes in the expression of PPTA mRNA in the rat trigeminal ganglion，during tooth movement in different periods，were detected using Dot-blot hybridization. Results The expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion was stonger than that in blank group and control group at all the time points； PPTA mRNA level was increased after 2 hours and reached the peak level around 8 hours to 3 days during tooth movement，7days after tooth movement PPTA mRNA level was still higher than in control group. Conclusion Orthodontic tooth movement can lead to a stonger expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion， suggesting that the PPTA may be involved in the occurrence of orthodontic pain.

Key words：substance P；PPTA；tooth movement；orthodontic pain；trigeminal ganglion；Dot-blot hybridization

疼痛是正畸治療中的一個常見反應[1]。正畸治療中牙齒疼痛與不適主要來源于牙周組織在改建時釋放的疼痛介質，是一個復雜的綜合性生理過程。而P物質（Substance P，SP）是發現最早的神經肽，目前已證實SP參與痛覺的傳遞[2]。牙齒及牙周組織中的SP是由三叉神經節（Trigeminal Ganglion ，TG）合成，PPTA是編碼SP的前體。在牙齒移動中，三叉神經節SP陽性神經元可能發生相應的改變。我們采用斑點雜交的方法檢測正畸牙齒移動不同時期大鼠三叉神經節內PPTAmRNA表達水平的變化，探討正畸牙齒移動導致疼痛的可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗分組、動物模型制備和取材：SD雄性大鼠，體重（180±20）g（7～9）周。加力裝置采用結扎絲將一根鎳鈦螺旋拉簧一端扎在上頜第一磨牙上，另一端結扎在上頜中切牙上，并用自凝塑料加固結扎絲與牙連接處。加力力值為50g，使磨牙向近中移動。大鼠隨機分為實驗組（安置裝置加力）、對照組（安置裝置不加力）。將實驗組和對照組根據不同時間分為以下亞組：2h組，8h組，1天組，3天組，7天組。每組5只大鼠，共50只大鼠。待大鼠達到規定時間點后，將動物乙醚吸入麻醉后迅速斷頭取三叉神經節，放入液氮中速凍。

1.2 組織總RNA的提取：采用異硫氫酸胍一步法提取大鼠三叉神經節總RNA。RNA純度260/280比值>1.9。

1.3 斑點雜交（Dot blotting）檢測：取總RNA加等體積的RNA變性液65℃變性30min。取10μg變性RNA點于尼龍膜，室溫靜止20min，按照1.5J/cm2 254nm波長紫外線照射1.8min待用。實驗用探針序列與大鼠腦內PPTAmRNA的第175號堿基到第204號堿基互補（5′-gatga tctaa attat tggtc cgact ggtcc -3′）。將尼龍膜和預雜交液封于雜交袋中，42℃預雜交16h，將標記探針2μg加入雜交袋中，42℃，12h。洗膜后探針檢測采用酶標抗地高辛抗體（過氧化物酶系統），DAB顯色。掃描儀掃描，計算個樣本灰度值。

1.4 統計學方法：實驗數據采用SPSS17.0統計軟件進行分析，實驗結果用x±s表示，組組之間采用t檢驗分析，P<0.05認為有統計學差異。

2 結果

斑點雜交檢測結果顯示不同時間點各對照組之間未發現顯著性差異；在正畸牙齒移動過程中大鼠三叉神經節PPTA mRNA的表達發生了明顯的變化，并具有一定的規律性。加力2h大鼠三叉神經節PPTA mRNA的表達量開始增加，加力8h至加力3天達到最高，至加力7天時PPTA mRNA水平仍然明顯高于對照組和空白組（P<0.05）。見圖1、表1。

3 討論

SP是最早發現的神經肽，由11個氨基酸組成，是1931年Von Euler等在研究馬體內乙酰膽堿時發現的一種物質。20世紀70年代分離純化了SP，進而確定了其組織結構，同時SP也是牙髓組織中發現的第一個神經肽[3]。三叉神經節中存在SP陽性神經元，并且主要位于中小神經元內[4]。三叉神經節初級感覺神經元是疼痛的起始部位。傳導口腔頜面部疼痛的初級感覺神經元位于三叉神經節。在牙齒移動中三叉神經節SP神經元興奮，引起SP的釋放，一方面釋放至外周末梢參與疼痛的發生，另一方面向上至三叉神經脊束核尾側亞核（caudal spinal trigeminal nucleus，VC）傳遞痛覺信息。

SP是公認的疼痛傳遞介質，具有增強傷害性信息傳遞的功能。SP被認為對疼痛信號的傳遞呈雙重作用，在傳人的神經元中為興奮性介質，但在高級中樞神經及其調制中則降低疼痛的敏感度。Henry等[5]認為，SP作為神經遞質在疼痛的感覺傳遞和鎮痛機制中發揮著重要作用。在正畸治療的初期，SP可能是導致牙齒輕微疼痛和不適癥狀的原因之一：（1）SP可使牙髓內局部血管擴張、通透性增加，髓腔內壓上升以至牙髓微循環障礙，導致C纖維興奮性增加，興奮閾值降低；（2）SP可以介導產生內源性致痛物質，間接引起C纖維興奮閾值降低[6]，如：①SP在C纖維支配的局部區域可引起血管擴張，通透性增加，血管內液體的深處可以激活緩激肽類物質；②SP作用于肥大細胞可使肥大細胞脫顆粒，釋放組胺等。SP的作用并不是孤立的，而是與神經系統及其它遞質相互作用、相互配合而發揮作用的。另一方面，神經系統不同部位、不同程度的損傷，SP的含量也隨著發生變化，通過測定SP的動態變化，可在一定程度上推測其功能的恢復情況。

本研究采用斑點雜交的方法觀察正畸牙齒移動不同時期大鼠三叉神經節內PPTAmRNA水平的變化情況，從SP中樞合成和mRNA水平來揭示正畸疼痛的變化規律。研究發現加力2h后PPTAmRNA的表達量開始增加， 加力 8h至加力3天達到高峰，至加力7天后仍然明顯高于對照組和空白組。該結果與Norevall的外周SP神經變化的發現相一致[7]。筆者發現大鼠正畸牙齒移動過程中三叉神經節PPTAmRNA的表達發生了明顯的變化，表達水平上調，并具有一定的規律性，說明牙齒移動的刺激能增強PPTA在大鼠三叉神經元的表達，表明牙齒移動產生了疼痛反應。SP經軸漿運輸到達三叉神經纖維外周端末梢并釋放到牙髓或牙周組織，參與牙齒移動導致的疼痛反應，SP也可能到達三叉神經纖維的中樞端并向三叉神經脊束核釋放，從而加強牙齒移動引起的痛反應。研究發現[8]：牙周疼痛發生時間在正畸加力后1～12h不等，平均為4～5h，在24～48h疼痛達到最高峰，加力后72h疼痛程度才逐漸減輕。可以看出，實際臨床中患者的疼痛規律和本研究發現的TG中PPTAmRNA的變化規律呈一定的相關性。說明SP參與了正畸疼痛的發生，但具體的作用機制還有待進一步的研究。

[參考文獻]

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[8]鄭衍亮.固定正畸治療時患者牙周疼痛影響因素的觀察[J].中國行為醫學科學，200l，10（4）：324-325.