雌激素受體在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的表達及意義＊

西安交通大學醫學院第二附屬醫院麻醉科 （西安710004）

韓新生 胡禮宏△ 呂建瑞 張蓬勃 王學良▲

肝臟缺血再灌注損傷在臨床上常見于失血性休克、肝腫瘤切除和肝移植等情況，也是目前肝臟保護研究的熱點。研究顯示雌激素對心、腦等器官的缺血再灌注損傷均具有保護作用［1－2］。近來研究發現肝臟缺血再灌注后雌性動物的存活率明顯要高于雄性動物，并發現雌激素對肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用［3－5］。研究發現肝臟中存在雌激素受體，但是目前未見有關雌激素受體在肝臟缺血再灌注損傷中的相關作用的報道。本研究建立肝臟缺血再灌注損傷模型觀察雌激素受體在雄性大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的表達情況及意義。

材料與方法

1 實驗材料 成年健康雄性SD大鼠90只，體重250±20g，由本大學實驗動物中心提供。17β－雌二醇由美國SIGMA公司提供；TNF－α試劑盒由上海森雄科技實業有限公司提供；NF－κBp65、ER試劑盒、DAB和SABC試劑盒由武漢博士德公司提供。

2 動物分組 90只大鼠隨機分成3組，每組30只。雌激素預處理＋肝缺血再灌注組（IRE組）：在肝缺血前1h腹腔注射雌二醇4mg／kg；肝缺血再灌注組（IR組）：肝缺血前1h腹腔注射等量生理鹽水；假手術組（PO組）：僅行麻醉、開腹、分離肝門、關腹，術前1h腹腔注射等量生理鹽水。分別于肝缺血前（T0）、再灌注1h（T1）、3h（T3）、6h（T6）和24h（T24）5個時點進行標本檢測，每個時間點6只大鼠。

3 動物模型建立 實驗前12h動物禁食，自由飲水。參照Pringle’s法阻斷大鼠第一肝門制備95%肝臟缺血再灌注損傷模型。用2%氯胺酮（0．5ml／100g）腹腔注射，取上腹部正中切口，顯露第一肝門部，用小號無損傷血管夾鉗夾肝蒂，阻斷門靜脈、肝動脈和膽總管，造成肝臟缺血，同時腹腔注射肝素（200U／kg）防止凝血，30min后松開血管夾恢復肝臟血供，關閉腹腔。分別在各時間點沿著大鼠劍突剪開胸腔，暴露心臟，右心室取4～6ml血液，分裝于Eppendoef導管中，室溫下1000g離心10min分離出血清，－20℃ 保存待測。同時取肝左中葉組織，用冰生理鹽水沖洗后用10%甲醛溶液浸泡固定，制作石蠟切片。

4 檢測指標 用全自動生化檢測儀檢測血清ALT水平；ELISA法測定血清腫瘤壞死因子－α；石蠟切片行HE染色，觀察肝臟組織形態學變化。

5 免疫組織化學檢測 切片行多聚賴氨酸處理，采用SABC法檢測肝組織NF－κB和ERα的表達情況。結果判定：400倍顯微鏡下，細胞核或（和）細胞漿呈棕色視為陽性肝細胞。每張切片隨機計數10個視野，觀察陽性肝細胞數（N1）和總細胞數（N），計算陽性率（N1／N×100%）。

結 果

1 血清轉氨酶水平變化 肝臟缺血再灌注后，血清ALT活性明顯升高。在IR組和IRE組，肝臟缺血再灌注后各個時間點ALT活性明顯高于缺血前，且隨著再灌注時間的延長而逐漸上升，于再灌注6h達到峰值，到再灌注24h時已顯著下降，但仍明顯高于缺血前。組間同時點比較IRE組明顯低于IR組（P＜0．05）。在PO組，缺血前后各時點的血漿ALT水平無明顯變化，見表1。

表1 大鼠肝缺血再灌注后各時點血漿ALT的活性比較（U／L，±s，n＝6）

表1 大鼠肝缺血再灌注后各時點血漿ALT的活性比較（U／L，±s，n＝6）

注：★P＜0．01vs組內T0；▲P＜0．01vs PO組；◆P＜0．05vs IR組

組別 T0 T1 T3 T6 T24 PO 65±15 80±13 82±19 89±25 75±20 IR 63±15 626±201★▲ 1062±256★▲ 1121±270★▲ 493±152★▲IRE 60±12 354±121★▲◆ 768±220★▲◆ 802±232★▲◆ 312±135★▲◆

2 肝臟組織形態學變化 假手術組各時間點肝組織變化無顯著性差異。IR組在缺血前肝組織同假手術組無明顯損傷，但再灌注后可見逐漸增多的肝細胞水腫和脂肪變性，再灌注6h時除可見增多的細胞水腫外，還可見點狀細胞壞死和嗜酸性變性，再灌注24h時仍可見細胞水腫和脂肪變性，但點狀細胞壞死和嗜酸性變性較再灌注6h時有所減輕，IR組各時間點較同期IRE組和PO組損傷加重；IRE組各時間點的變化趨勢同IR組，但各時點的損傷程度輕于IR組。

3 肝臟組織NF－κB表達情況 在各組動物肝組織中均可見NF－κB不同程度的表達。假手術組各時間點NF－κB表達無顯著性差異。在IR組和IRE組隨著再灌注時間的延長NF－κB表達程度越高，再灌注后同時點比較，IR組NF－κB的表達明顯高于IRE組（P＜0．05），兩組的表達水平明顯高于假手術組（P＜0．01），見表2。

表2 大鼠肝臟組織NF－κB表達情況（%）

4 血漿中TNF－α水平的變化 肝臟缺血再灌注后各個時間點TNF－α活性隨著再灌注時間的延長而逐漸上升，IR組于再灌注6h達到峰值，至再灌注24h時開始降低，但仍明顯高于缺血前。IRE組血漿中TNF－α活性的變化趨勢同IR組，組間同時點比較明顯低于IR組，但明顯高于PO組，組間比較存在顯著性差異。PO組的血漿TNF－α活性與缺血前比較有所上升，但各時點組間比較差異無統計學意義，見表3。

表3 大鼠肝缺血再灌注前后血清TNF－α活性的比較（pmol／ml，±s，n＝6）

表3 大鼠肝缺血再灌注前后血清TNF－α活性的比較（pmol／ml，±s，n＝6）

注：★P＜0．01vs組內 T0；▲P＜0．01vs PO 組；◆P＜0．05vs IR組

組 別 T0 T1 T3 T6 T24 PO 8．21±0．92 10．65±1．35 12．32±2．13 13．56±2．23 10．23±1．56 IR 8．12±0．95 60．59±7．66★▲ 76．54±8．98★▲ 80．67±11．23★▲ 45．54±7．23★▲IRE 8．02±0．89 36．68±8．96★▲◆ 45．55±10．32★▲◆ 55．35±9．96★▲◆ 25．78±8．56★▲◆

5 肝臟組織ER表達情況 假手術組各時間點肝臟組織ER表達水平無顯著性差異。隨再灌注時間的延長肝臟組織ER表達程度明顯增強，至再灌注6h時表達水平達峰值，至再灌注24h時表達水平有所降低，但組間各時點比較，IRE組的ER表達水平明顯高于ER（P＜0．05），見表4。

表4 大鼠肝臟組織ER表達情況（%）

討 論

肝臟缺血再灌注損傷在臨床上比較常見，是導致肝功能衰竭的重要原因，也是目前研究的熱點問題。肝臟缺血再灌注損傷的發生機制目前還未完全闡明，多數研究認為可能與肝臟無氧代謝，pH悖論，Ca2＋超載，氧自由基損傷，線粒體受損，微循環功能障礙，各種細胞因子作用，Kupffer細胞和中性粒細胞活化，核轉錄因子κB的激活以及細胞凋亡等有關。據大量研究報道，雌激素對腦、心等臟器缺血再灌注損傷具有保護作用，Harada等［3］研究發現肝臟缺血再灌注損傷后雌鼠的存活率明顯高于雄鼠，而且用雌二醇治療的雄鼠肝細胞損害程度顯著輕于對照組，提示雌激素對肝缺血再灌注損傷有保護作用。本研究結果顯示，用雌激素處理后，能夠反映肝功能的血清AST水平明顯下降，肝細胞損傷程度卻明顯減輕，這與已有的研究結論基本一致［4－5］。

雌激素受體（ER）是核受體超家族成員之一，位于胞漿和胞核內，具有轉錄因子的作用［6－7］。雌激素與其受體結合才能發揮作用。目前還未見雌激素受體在肝缺血再灌注損傷中相關作用的報道，本研究結果顯示，肝臟缺血再灌注后肝組織雌激素受體表達升高，而雌激素預處理組雌激素受體的表達顯著高于缺血再灌注組，肝臟損傷程度也明顯減輕，說明雌激素預處理后刺激雌激素受體的高表達，能夠減輕肝臟缺血再灌注損傷。促炎性因子TNF－α在肝臟缺血再灌注損傷過程中起到重要作用，TNF－α可觸發細胞凋亡；TNF－α直接導致肝竇內皮細胞腫脹；通過中性粒細胞，內皮細胞的相互作用導致肝臟微循環障礙［8］；激活中性粒細胞釋放氧自由基［9］；刺激單核巨噬細胞和其它細胞分泌IL－1，IL－6等炎性因子。在本研究中，再灌注后IR組血漿TNF－α活性明顯升高，而IRE組TNF－α活性明顯低于IR組。由此說明雌激素受體的高表達可以顯著降低肝缺血再灌注中TNF－α的水平，繼而減輕肝缺血再灌注損傷。

肝臟缺血再灌注可引起缺血缺氧、氧化應激、Ca2＋超載，中性粒細胞釋放多種蛋白酶以及活性氧，Kupffer細胞活化等多種途徑激活 NF－κB，NF－κB 激活后通過調節一系列基因的表達，如釋放前炎癥細胞因子 TNF－α、IL－1、IL－6、細胞黏附分子－1、血管細胞黏附分子－1、選擇素等直接或間接地參與肝缺血再灌注損傷［10－12］。本研究結果顯示，肝缺血再灌注后肝組織NF－κB表達明顯升高，雌激素預處理組明顯低于缺血再灌注組，肝臟損傷也明顯減輕，雌激素受體表達增加，說明雌激素受體的高表達能夠抑制NF－κB的表達，進而減輕肝臟缺血再灌注損傷。

綜上所述，雌激素預處理可增強雌激素受體在缺血再灌注損傷肝臟組織中的表達，降低血清ALT、TNF－α水平和 NF－κB的表達，減輕肝臟組織損傷程度。雌激素預處理能刺激并增強雌激素受體的表達，進而減輕肝臟缺血再灌注損傷，其機制可能與抑制了NF－κB的表達和降低血清TNF－α水平有關。

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