rAAV－hBMP7的包裝純化及感染滴度的測定※

西安交通大學口腔醫院 （西安710004） 石建峰 饒國洲 魏 虹 張 晨 李 昂

骨形成蛋白（BMPs）是一類具有多種功能的生長因子，屬于轉化生長因子β超家族，具有明顯促成骨作用的細胞因子，參與機體胚胎發育、骨骼形成及組織器官發生等生命過程。人骨形成蛋白7（Human bone morphogenetic protein－7，hBMP7）是其中促成骨作用較強的一個成員，具有較強的骨誘導能力及維持軟骨細胞的表型、促進細胞外基質如蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成、促進有成骨作用的細胞分化等能力，在體內外均能誘導形成骨組織、牙本質，不僅可實現牙槽骨的再生，還可明顯提高牙骨質再生量，是組織工程技術常用的一種細胞因子［1］。

基因轉移載體的選擇，決定著治療基因能否進入種子細胞并實現有效表達，是基因治療和組織工程技術的關鍵環節。重組腺相關病毒［2］（Recombinant adeno－associated virus carrierr，rAAV）宿主范圍廣，既能感染分裂期細胞也能感染非分裂期細胞；能將其基因組DNA定點整合到宿主細胞染色體上，使攜帶的外源基因在宿主體內持續穩定表達，且不引起宿主基因突變。以rAAV為基礎構建的病毒載體，已經在科學研究領域及多種疾病的基因治療方面得到了廣泛的應用。

本組擬利用前期構建并鑒定正確的腺相關病毒載體pAAVIRES－hrGFP－hBMP7［3］，應用 AAV Helper－Free System、磷酸鈣三質粒共沉淀法，在AAV－293細胞內包裝具有感染性的腺相關病毒rAAV－hBMP7，按氯仿處理、PEG／NaCL沉淀的方法濃縮純化；并測定其包裝效率及感染AAV－HT1080細胞后的感染效率和滴度，為組織工程技術治療牙周組織缺損做基礎性研究。

材料與方法

1 試驗材料 AAV Helper－Free System、AAV－293細胞、AAV－HT1080細胞、pAAV－GFP質粒、胎牛血清、L－DMEM 培養基、H－DMEM 培養基購自美國Stratagene公司；高純度質粒大提試劑盒購自北京TIANGEN公司；磷酸鈣法細胞轉染試劑盒、β－半乳糖苷酶原位染色試劑盒購自碧云天（Beyotime）公司；氨芐青霉素、鏈霉素購自北京奧科；其余試劑為國產分析純。

2 實驗方法

2．1 質粒轉化 制備含 Amp（50μg／m1）的LB固體平板，流水下快速解凍DH5α感受態細胞，加入1 μl pAAVIRES－hrGFP－hBMP7質粒，輕輕旋轉混勻，冰浴30min；42℃熱休克90s；冰浴2min，加入預熱至37℃的LB液體培養基400μl，37℃，搖床轉速＜50r／min溫育45min，使細胞復蘇并表達質粒編碼的抗性基因；取100μl菌液涂于含X－gal和IPTG的瓊脂平皿，于37℃培養16～18h；終止培養后，將平板置4℃冰箱1～4h，使藍白斑篩選實驗充分顯色。同法對輔助質粒pAAV－Helper和包裝質粒pAAV－RC進行轉化。

2．2 質粒大量提取及濃度和純度測定 每種質粒隨機挑取3個轉化陽性克?。ò咨寺。骷尤氲? ml LB液體培養基中（含 Amp 50μg／ml），37℃、225 r／min震蕩培養3h，分別加入到裝有250ml LB液體培養基（含 Amp 50μg／ml）的500ml三角燒瓶中，37℃、225r／min震蕩培養過夜，測A600處OD值＞0．60，質粒大提試劑盒提取質粒，進行濃度和純度測定。用BamHI／SalI雙酶切鑒定重組病毒質粒pAAVIRES－hrGFP－hBMP7。

2．3 AAV－293細胞培養 在37℃水浴中快速解凍AAV－293細胞，將細胞懸液轉移到裝有10mlDMEM培養液的錐底離心管中，室溫下以200g的速度離心3min吸除上清液，重新加入5ml新鮮DMEM輕輕吹打重懸細胞，轉移到一個裝有10mlDMEM（氨芐青霉素100U／ml和鏈霉素100μg／ml）的75cm的組織培養瓶中，37℃、5%CO2條件下培養。細胞生長至50%融合時傳代培養。

2．4 三質粒共沉淀法AAV－293細胞包裝rAAV－hBMP7 將AAV－293細胞種植于6孔培養板內，3×105／孔，培養至70～80%融合。采用AAV Helper－Free System／磷酸鈣三質粒共沉淀法轉染AAV－293細胞（以下為每孔加液量）。轉染前30～60min，吸去培養液，加入新鮮的不含抗生素的DMEM完全培養液4ml。分別取純度1．80以上的pAAV－Helper、pAAVIRES－hrGFP－hBMP7 和 pAAV－RC 各 10μl（1μg／μl），加入到 100μl氯化鈣溶液中混勻，對照組以pAAV－GFP代替病毒質粒。把DNA－氯化鈣溶液加入到100μl BBS溶液中混勻，室溫孵育20min均勻滴加到整個孔內。實驗組10孔，對照組1孔，陰性對照1孔／板。37℃，5%CO2的培養箱中培養。12h后輕輕晃動培養板數次，吸去含磷酸鈣沉淀的培養液，加入2ml新鮮的完全培養液繼續培養72h，收集細胞，期間倒置顯微鏡下觀察細胞形態及熒光表達情況。

病毒包裝完成后，取平行對照rAAV－GFP組細胞培養皿，倒置熒光顯微鏡下隨機選取高倍視野下（400×）10個視野，計數視野內表達熒光細胞數量及細胞總數計算rAAV－hBMP7的包裝效率。

2．5 病毒液的收集和純化 用細胞刮刀把貼壁細胞全部刮落到培養液中，轉移到一消毒、預冷的50ml離心管中，反復凍融四次（干冰浴和37℃水浴），每次凍和融的時間為10min左右。每次融化后輕輕漩渦振蕩離心管。12000r／min離心10min除去細胞碎片。將含病毒的上清轉入一新的試管中。

向病毒液中（40ml）加入1／10體積的氯仿，37℃，300rpm／min劇烈振搖1h。加入固體氯化鈉2．56g至終濃度為1mol／L，4℃、12000r／min離心30min，收集上清于一新的50ml離心管中，加入PEG8000 4．5g至終濃度10%，劇烈振搖直至完全溶解，冰浴1h。4℃，12000r／min離心30min棄上清，4ml PBS溶解沉淀，以每份0．5ml分裝在1．5ml EP管中，–80℃保存。命名為rAAV hBMP7。

2．6 rAAV hBMP7感染 AAV－HT1080細胞將AAV－HT1080細胞復蘇及傳代培養（方法和步驟同AAV－293細胞的復蘇與傳代）。用L－DMEM調節細胞密度為1．5×105／ml，種植于12孔培養板，每孔1ml，37℃培養至70%融合。每孔加0．2ml AAV Permissive Growth Medium，（保留最初的培養液），漩渦振蕩混合細胞，37℃孵育5～6h 吸除孔內液體，用37℃預溫的L－DMEM 洗滌細胞1次。用L－DMEM將純化的病毒原液0．1ml按10×的濃度梯度稀釋為10－2，10－3，10－4，10－5，10－6。分別加入各培養孔，每濃度組設3孔，每孔0．5ml，在37℃孵育培養板2h，其間每30min輕輕漩渦振蕩培養板幾次。各加0．5ml預溫的H－DMEM，繼續培養48h。期間倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞形態結構及熒光表達情況。

2．7 β－半乳糖苷酶染色法測定rAAV hBMP7感染效率和滴度 AAV－HT1080細胞培養至48h，吸出培養液，用L－DMEM洗滌細胞一次，原位β－半乳糖苷酶染色試劑盒固定并染色細胞。每孔加0．5mlβ－半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10min；吸除固定液，用PBS洗滌細胞3次，每次3min；每孔加入0．5ml染色工作液（10μlβ－半乳糖苷酶染色液 A ＋10μlβ－半乳糖苷酶染色液B＋930μlβ－半乳糖苷酶染色液C＋X－Gal溶液50μl）；37℃孵育20min至2h，直至部分細胞顏色變藍。顯微鏡下觀察并計數一定細胞中藍色細胞的個數，計算rAAV hBMP7感染效率，感染效率＝染色陽性細胞數／計數細胞總數×100%，并估算病毒原液感染滴度。

結 果

1 質粒濃度和純度 提取的pAAVIRES－hrGFP－hBMP7質粒，經紫外分光光度儀檢測，在260nm處OD值為0．56，OD260／OD280＝1．79；OD260值為1．0相當于大約50μg／ml雙鏈DNA，質粒稀釋倍數為40，計算得質粒濃度為1．12mg／ml（1．12μg／μl）。同法計算包裝質粒pAAV－RC的濃度為1．08μg／μl，純度為1．81；輔助質粒pAAV－Helper濃度為1．22μg／μl，純度為1．82，純度和濃度均符合后繼實驗要求。

2 pAAVIRES－hrGFP－hBMP7雙 酶切 鑒 定 用BamHI／SalI雙酶切重組病毒質粒pAAVIRES－hrG FP－hBMP71．2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示6100bp和1300bp區域有兩條DNA條帶（見圖1），與病毒載體 質 粒 pAAVIRES－hrGFP（6．1Kb）及 目 的 基 因hBMP7（1296bp）大小一致。雙酶切圖譜說明所提質粒為前期構建并鑒定的質粒pAAVIRES－hrGFP－hBMP7。

3 rAAV hBMP7在293細胞內的包裝

3．1 包裝6h細胞形態結構和熒光表達情況 病毒包裝6h后，倒置顯微鏡低倍下觀察可見rAAVGFP組、rAAV－hBMP7組AAV－293細胞形態正常、生長狀態良好。提示磷酸鈣共沉淀物對AAV－293細胞生長干擾較小，底部可見少量細小的顆粒，為殘余的磷酸鈣共沉淀物；高倍鏡下觀察AAV－293可見細胞漿中含有較多極細小的磷酸鈣顆粒（見圖2）。倒置熒光顯微鏡觀察，陰性組無熒光，rAAV－GFP組和rAAV－hBMP7組均出現熒光表達，以對照rAAV－GFP組為明顯（見圖3）。提示病毒在293細胞內已經獲得“拯救”、包裝，并隨細胞的分裂而復制，報告基因也已經開始表達。

圖1 質粒pAAVIRES－hrGFP－hBMP7雙酶切圖M：DNA MakerⅥ，1：BamHI／SalI 雙酶切

圖2 包裝6h后AAV－GFP組倒置顯微鏡下AAV－293細胞表型變化（A：100×；B：400×）

圖3 包裝12h后AAV－GFP組熒光表達（A：普通倒置顯微鏡；B：倒置熒光顯微鏡；400×）

3．2 包裝72h觀察 陰性組始終無熒光發出（圖4A，D），隨培養時間延長，rAAV－GFP組（見圖4 B，E）和rAAV－hBMP7（見圖4C，F）組培養基顏色逐漸變為棕黃色，板底細胞表面有沉淀物形成，上清中也有大量絮狀物出現，細胞形態變的不規則，有相互融合的趨勢。兩組細胞表達熒光的細胞數量及熒光強度也隨包裝時間延長而增加，72h時絕大多數細胞都發熒光。各組細胞同一視野下形態結構及熒光表達情況見圖4。

3．3 包裝效率 病毒包裝完成后，取平行對照rAAV－GFP組細胞培養皿，倒置熒光顯微鏡下隨機選取高倍視野下（400×）10個視野，計數視野內表達熒光細胞數量及細胞總數，取平均值計算rAAV－hBMP7包裝效率為94．16±0．13%。

圖4 包裝72h倒置顯微鏡下AAV－293細胞表型變化及倒置熒光顯微鏡下GFP表達

4 rAAV－hBMP7感染AAV－HT1080細胞熒光表達 純化的rAAV－hBMP7各濃度組感染AAVHT1080細胞后，12h左右均有表達綠色熒光的細胞出現。隨著培養時間的延長，高濃度組細胞從培養板底面脫離，細胞結構破壞，相互融合，熒光表達也融合成片，繼續培養則熒光表達下降；低濃度組細胞界限清晰，結構較正常，細胞損傷輕微，熒光表達清晰持久（見圖5），6～7d達到高峰。

5 原位β－半乳糖苷酶染色法測定rAAV hBMP7感染效率和病毒滴度 rAAV－hBMP7轉染易感細胞AAV－HT1080后，病毒復制，病毒載體上的β－半乳糖苷酶基因表達，催化底物X－Gal顯色，細胞被藍染。選擇細胞形態保持較完整、數量適中（10＜n＜100）的濃度組，光學顯微鏡下計數10不同視野中的藍染細胞數，計算轉染效率：鏡下觀察發現10－5，10－6兩個組細胞形態完整（見圖6A），界限清晰；其他組別細胞形態損傷嚴重，細胞邊緣模糊、破裂相互融合（見圖6B），提示病毒顆粒過多，細胞發生毒性改變。計算轉染效率10－5組約為78%；10－6組約為35%。參照細胞形態變化情況可以確定，實驗獲得的rAAV－hBMP7作10－5稀釋可以獲得78%的較好轉染效率；以該組別轉染效率推算病毒感染滴度：種植細胞數／ml×感染效率×病毒實際稀釋倍數（1／稀釋用量0．1ml÷稀釋后濃度值10－5÷每孔病毒用量0．5ml），rAAV hBMP7的滴度約為2．34×1011v·g／ml，可用于后繼實驗。

圖5 rAAV－hBMP7（10－5 組）感染 AAV－HT1080細胞72h后熒光表達（A：倒置顯微鏡；B：倒置熒光顯微鏡；×100）

圖6 原位β－半乳糖苷酶染色結果（200×）

討 論

骨形成蛋白（BMPs）存在于骨、牙本質等多種組織中，對骨組織的發育和修復重建起著關鍵性作用，BMP7是BMPs家族中促成骨能力最強的生長因子之一［4］。研究發現BMP7誘導新骨形成，一般是通過三步多分子級聯放大反應來產生成骨效應［5］。①誘導細胞趨化，促進特定的細胞群發生方向性趨化，進而誘導細胞黏附和增殖；②誘導和促進有絲分裂；③誘導細胞分化，BMP－7能夠誘導多種細胞向成骨型細胞分化，促進細胞基質合成，I型、II型膠原、ALP、骨鈣素等的基因表達升高。

在口腔領域，許多學者嘗試將BMP7或BMP7復合其它因子用于牙周組織工程中，刺激牙周膜中的潛在細胞群分化增殖，促進牙周和頜面部組織缺損的修復與重建。Jin等［6］利用BMP－7基因修飾的皮膚成纖維細胞，附合凝膠載體支架，修復小鼠下頜牙槽骨缺損的實驗發現，轉染組小鼠在骨缺損部位有軟骨的快速形成，繼而形成骨及牙骨質。Yeh［7］等的研究發現，BMP7能促進分化的成骨細胞高表達骨鈣素及堿性磷酸酶，誘導形成鈣化結節，細胞成骨活性增強。證實了rhBMP－7的促成骨特性。本課題應用前期構建并鑒定的pAAVIRES－hrGFP－hBMP7質粒，制備有感染性的rAAV病毒，以期獲得hBMP7在真核細胞內的表達，為牙周組織缺損的治療做基礎性研究。

腺相關病毒載體具有能在人類染色體定點整合、長期穩定表達而無致癌隱患，轉染效率高而免疫原性低等優點，是近年來研究和應用最廣的一種病毒類載體［8］。Kunze等［9］比較了1～5型AAV 對牙周膜細胞、牙齦細胞感染效率的差別后發現，各型的轉染效率存在差別，以AAV2最高，AAV4最低，其它三型介于這倆型之間。rAAV病毒的包裝，主要涉及包裝容量、包裝體系和病毒純化幾個方面。包裝容量小是rAAV載體最大的缺陷，僅為5kb左右，很多情況下不能滿足基因治療的需要，如何增加rAAV載體的包裝容量成為擴大其應用的熱點課題［10］。本組采用的pAAVIRES－hrGFP質粒，僅保留了AAV包裝和整合不可缺少的ITRs，不僅增加了包裝容量，在兩個ITRs之間還有一核糖體基因IRES，可以實現雙基因共表達，又能促使AAV的核內定位。

rAAV傳統的包裝體系不僅步驟繁瑣，而且存在AV的污染難以完全去除。本組采用的AAV Helper－Free System，就是對其不斷改造的基礎上建立的比較完善的包裝體系［11］。其中的pAAV－RC表達AAVCap和Rep蛋白；pHelper含有與AAV包裝有關的腺病毒基因E4、E2a和VA RNA；E1a和E1b則由293包裝細胞提供；該系統不僅簡化了操作、提高了產量，而且避免了野生型AAV和AV的污染。本實驗應用該系統包裝6h時，各組都出現熒光表達，說明該系統病毒“拯救”很快，而且細胞形態正常、生長狀態良好。

病毒純化的目的是去除可能的AV和野生型AAV污染，及可復制性AAV（rcAAV）雜質（含有非目的基因DNA序列的類AAV顆粒）［12］。傳統的方法是硫酸銨濃縮、氯化銫密度梯度離心，操作繁瑣，病毒液損失太多［13］。近年來，吳小兵等［14］提出的氯仿處理－PEG／NaCl沉淀－氯仿反復抽提的方法，對rAAV病毒原液進行濃縮和純化，效果較為滿意。

病毒感染效率和滴度的測定，許多研究者［15］應用AAV易感細胞（HT1080）表達熒光的細胞數（或百分比）來進行估算，簡便易行，但是計數結果容易受培養基底色和熒光折射的影響，估算結果有較大偏差。本組采用原位β－半乳糖苷酶染色，計數藍染細胞個數，細胞間干擾小，而且能觀察病毒顆粒對細胞形態的影響情況。

本組應用磷酸鈣三質粒共沉淀法，成功制備了rAAV－hBMP7，通過對照組AAV－GFP表達熒光的細胞數量，測定包裝效率為94．16±0．13%。原位β－半乳糖苷酶染色估算rAAVhBMP7病毒原液的感染滴度為2．34×1011v．g／ml?？捎糜诤罄^實驗的細胞轉染。

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