188Re直接標記單克隆抗體TGLA及其生物學評價

溫 凱，張君麗，陳寶軍，陳大明，崔海平

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

單克隆抗體的問世極大地促進了抗體在各個領域的應用，但單克隆抗體大部分為鼠源性抗體，作為異種蛋白會誘發人體產生免疫反應，目前，臨床上的應用只局限于檢測與診斷，在體內治療上的應用發展緩慢。近年來，單克隆抗體的鼠源性問題己通過抗體人源化、噬菌體抗體庫及轉基因動物等技術得到解決，本實驗所標記抗體為一種特異性靶向CD20的嵌合抗體，命名為TGLA。CD20是人類B淋巴細胞表面特有的標識，不會發生明顯的內化和脫落，是治療非霍奇金淋巴瘤理想的靶抗原。嵌合抗體TGLA能特異性的結合CD20，并可通過CDC 和ADCC作用特異性地殺傷CD20+人B細胞淋巴瘤Daudi和Raji細胞；同時能夠抑制Raji腫瘤細胞生長[1]。抗CD20單克隆抗體作為一種新的有效抑制腫瘤細胞增長的治療方案，已應用于臨床治療B細胞淋巴瘤。

188Re標記的單克隆抗體已大量用于腫瘤的顯像與治療。Re和Tc同處于周期表第Ⅶ族，具有類似活潑的化學性質，像Tc一樣可以形成許多穩定的配合物。188Re通過188W-188Re發生器生產，簡便易得，更重要的是，188Re的半衰期為16.9 h，188Re[2]放射出的2.12 MeV (71.4%) 和1.96 MeV (25.8% ) β射線可以用于治療，向腫瘤傳遞較高的輻射劑量，并對靶向腫瘤細胞附近的抗原表達陰性的非靶向腫瘤細胞也有殺傷作用，同時可以利用155 keV (15.0% ) 的γ射線進行顯像。

本實驗應用直接標記法[3-7]對TGLA進行188Re標記，制備得到188Re-TGLA，對標記條件進行優化，研究188Re-TGLA在荷淋巴瘤裸鼠體內的生物分布。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

單克隆抗體TGLA：軍事醫學科學院提供；188Re淋洗液：原子高科股份有限公司生產的188W/188Re發生器制備；葡萄糖酸鈉、SnCl2·2H2O、NaHSO3、抗壞血酸：國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.2 主要儀器

FT-603井型γ閃爍探測器、FH463A自動定標器：北京核儀器廠；BS110S分析天平：德國賽多利斯公司。

1.3 實驗動物

裸鼠：10只，鼠齡3周，體重18～22 g，由中國醫學科學院腫瘤醫院提供，腋下種植淋巴癌細胞株，腫瘤直徑約0.5 cm時備用。

2 實驗方法

2.1 188Re直接標記法

2.1.1TGLA的還原

取0.1 mL TGLA的PBS溶液(1 g/L， pH 5.0)，10 μL 0.16 mol/L NaHSO3溶液，NaHSO3與單抗物質的量比為 1 500∶1，混合搖勻，室溫下反應45 min。

2.1.2TGLA的188Re標記

用20 μL抗壞血酸(0.1 mol/L) 保護單抗還原溶液，然后加入175 μL 0.5 mol/L pH 5.0的葡萄糖酸鈉溶液為緩沖液，并作為抗體標記的中間配體，50 μL 25 g/L SnCl2溶液(溶于0.05 mol/L HCl)，最后加入100 μL Na188ReO4淋洗液(約5.6 MBq)，反應2.5 h。

2.2 標記率的測定

以生理鹽水體系和V(乙醇)∶V(氨水)∶V(水)=2∶1∶5混合溶液為展開體系，利用兩展開體系的互補性測定188Re-TGLA標記率，其中，在生理鹽水體系中188Re-TGLA及膠體Rf=0，188ReO4-的Rf=0.7。乙醇體系中的膠體Rf=0，而188Re-TGLA及188ReO4-的Rf=0.75。放射性HPLC柱填料為Bio-Sil SEC 250，流動相為0.1 mol/L PBS溶液，進樣量10 μL。

2.3 標記條件的優化

(1)還原時間和SnCl2用量的選擇

取175 μL 0.5 mol/L pH 5.0的葡萄糖酸鈉溶液作為緩沖液，50 μL 25 g/L SnCl2溶液，加入100 μL 5.6 MBq的Na188ReO4淋洗液進行還原反應。分別取15、30、45、60 min時的反應液，以Whatman試紙為固定相，以生理鹽水作為展開劑檢測Na188ReO4還原率。測定還原時間對Na188ReO4還原率的影響。保持以上條件不變，分別取10、30、50、70、90 μL 25 g/L SnCl2溶液，還原反應45 min，測定SnCl2用量對188Re-TGLA標記率的影響。

(2)pH、中間配體和標記時間的選擇

分別選用三種不同的中間配體：檸檬酸和酒石酸1∶5的混合溶液、檸檬酸、葡萄糖酸鈉，在最佳標記條件下分別進行標記物的合成，測定Na188ReO4還原率與188Re-TGLA標記率。

保持其他反應條件不變，當反應pH為5.0時，分別考察標記時間為1.0、1.5、2.0、2.5 h時188Re-TGLA標記率；反應時間為2.5 h時，改變葡萄糖酸鈉的pH，分別考察pH為4.0、4.5、5.0時188Re-TGLA標記率。

2.4 體外穩定性的測定

實驗采用PBS法進行188Re-TGLA穩定性的測定，取150 μL含188Re-TGLA的試劑約5.6 MBq，置于1 mL pH 5.0磷酸緩沖液中，恒溫37 ℃下，分別孵育1、2、4、8、24 h后，紙層析法測定其放化純度，以觀察其體外穩定性。

2.5 荷瘤裸鼠體內分布

將制備的188Re-TGLA用凝膠柱純化后備用。取正常小鼠10只，隨機分成2組，每組5只，分別經尾靜脈注射10 μL約7.4×105Bq 的188Re-TGLA生理鹽水溶液，分別于注射后24 h、48 h時處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、肌肉、骨頭、血、腫瘤等組織稱重并測量計數。經衰變校正后計算各組織放射性攝取率(%ID/g)。

3 結果與討論

3.1 188Re-TGLA標記率

188Re-TGLA的HPLC結果示于圖1，由圖1可見，188Re-TGLA保留時間為9.14 min，標準品的保留時間為11.39 min，188Re-TGLA標記率為93%。

圖1 188Re-TGLA的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatography of 188Re-TGLA

3.2 標記條件的選擇

3.2.1還原時間對還原率的影響

還原時間對Na188ReO4還原率的影響結果示于圖2。還原反應進行到45 min前，還原率逐漸升高，反應至45 min時達最大值87%，反應繼續進行，還原率略有下降。這是由于反應時間過長，還原后的Re和Sn形成了Re-Sn膠體，影響了反應的進度，不利于反應的繼續進行，影響最終的標記率，因此，最佳的還原時間選定為45 min。

圖2 還原時間對Na188ReO4還原率的影響Fig.2 Effect of reduction time on reduction rate

3.2.2SnCl2用量對Na188ReO4還原率的影響

由圖3可見，隨著SnCl2用量的增加，還原率不斷上升，用量為1.25 μg時最高，之后隨著SnCl2用量的不斷增加，還原率略有下降，這是由于過量的Sn與Re生成膠體，使還原率降低。確定SnCl2用量為1.25 μg。

圖3 SnCl2用量對Na188ReO4還原率的影響Fig.3 Effect of SnCl2 mass on reduction rate

3.2.3中間配體的選擇

中間配體可與188Re 保持弱的絡合作用，以使188Re處于穩定低價態，保證后續配位交換反應得以順利進行。它又起著穩定Sn2+的作用，減少其水解。這三種中間配體的配合能力不同，與Re的結合能力不同。其中，檸檬酸和酒石酸都是結合能力強的配體，葡萄糖酸鈉配位能力較弱，使Re順利標記到抗體上，與檸檬酸鹽、酒石酸鹽相比，其標記實驗條件易掌握、標記物穩定、放化純度高。在標記反應中加入適量抗壞血酸保護溶液，穩定低價態的Re，增加標記物的體外穩定性，又可抑制疏基的氧化，提高標記率。

不同的配體下，188Re-TGLA的還原率與標記率列于表1，由表1可見，檸檬酸與酒石酸的混合配體溶液有一定的還原性，也可以進行標記，但是標記率與還原率都很低；檸檬酸的結合力很強，還原率高，但無法用于標記；葡萄糖酸鈉具有較高的還原率，而且標記率高。這可能是由于檸檬酸的結合能力強，使還原后的Re很難與抗體結合，而葡萄糖酸鈉的配合能力相對較弱，可以將還原后的Re標記到抗體上。

表1 不同配體進行標記的還原率與標記率

3.2.4標記時間對標記率的影響

標記時間對標記率的影響結果示于圖4。反應2 h，標記率隨時間的增長不斷升高，到2 h標記率趨于穩定，標記率最高達87%，繼續反應標記率略有下降。因此，選擇標記時間為2～2.5 h，反應時間過長，Re與Sn可能會產生膠體，影響標記率。

圖4 標記時間對標記率的影響Fig.4 Effect of labeling time on labeling yield

3.2.5pH對標記率的影響

由于SnCl2必須存在于酸性溶液中， pH的范圍選定必須在5.5以下，為了保證抗體的活性，避免Re形成膠體，pH必須保持在3.5以上。因此，在實驗中選定了pH 4.0、4.5、5.0三個點測定其標記率。結果顯示，pH對標記率的影響不大，為了減少膠體的產生，選擇pH為5.0。

3.3 體外穩定性

188Re-TGLA體外穩定性結果示于圖5。由圖5可以看出，在24 h內其放化純度保持較好，仍≥85%，基本維持穩定。結果表明，188Re-TGLA的體外穩定性較好。

圖5 188Re-TGLA體外穩定性Fig.5 188Re-TGLA’s vitro stability

3.4 188Re-TGLA在荷淋巴瘤裸鼠體內的分布

188Re-TGLA在荷淋巴瘤裸鼠體內的分布結果列于表2。由表2可見，在給藥24 h后，該藥物在腫瘤攝取較高，血液和肝臟和腎臟攝取較高，在脾，肺等器官也有一定的攝取。在48 h后，血液中仍有較強攝取，腫瘤的攝取降低，肝臟仍有一定的攝取，肝清除較慢，其他器官的攝取降低。此數據表明，該抗體在腫瘤中有一定的攝取，在肝臟有一定的富集，血液24 h攝取較高，清除較慢，48 h攝取有明顯下降。由于該抗體在血液中的清除速度較慢，生物半衰期較長，在24 h并未到達各臟器及腫瘤，導致腫瘤攝取較低，血液中仍有較高攝取。

表2 188Re-TGLA的荷瘤裸鼠體內分布

腫瘤與其他器官的放射性攝取比(T/NT)列于表3中，由表3可見，各器官的T/NT隨時間的增長均下降，這說明該藥物在腫瘤中最佳的顯像時間是24 h以內，在體內清除較慢，而且188Re的半衰期為16.9 h，相對于抗體的生物半衰期而言，188Re半衰期較短，對于顯像來說是一個不利因素；在肝臟中清除較慢，停留時間較長，也增加病人所承受的劑量。減少抗體的體內半衰期，可以使用單克隆抗體的片段進行標記，與188Re的半衰期匹配，以達到更好的顯像效果。

表3 188Re-TGLA在荷瘤裸鼠體內的T/NT

4 結 論

本實驗通過優化188Re直接標記條件，標記率達93%，荷瘤裸鼠體內分布實驗結果顯示，在腫瘤有一定的攝取，肝腎也有較強的攝取，但在血液中清除較慢。這是由于188Re的半衰期較短，相對TGLA的生物半衰期較長，單克隆抗體TGLA的血液清除速度較慢，到達腫瘤的時間較長，導致在腫瘤的攝取并未達到預期效果，而且在肝臟的清除較慢也增加了患者的劑量。在今后的實驗中可以嘗試采用188Re直接標記抗體片段，降低抗體的生物半衰期，匹配188Re的半衰期，以達到更好的顯像效果。

參考文獻：

[1] 耿樹生 孫瑛勛 谷欣，等. 新型抗CD20 嵌合抗體TGLA 體內、外活性的研究[C]. 第九屆全國生物治療會議，2006：48-49.

[2] 劉文彬，李玉，張漢文.188Re 標記單克隆抗體3H11的條件研究及其在荷瘤裸鼠體內的生物分布[J]. 同位素，1999，4(12)：208-211.

Liu Wenbin, Li Yu, Zhang Hanwen. Study on labeling conditions of monoclonal antibody 3H11 with188Re and its biodistrybution in tumor-bearing nude mice[J]. Journal of Isotopes，1999，4(12)：208-211(in Chinese).

[3] 吾為一，范我，鮑君杰，等.188Re標記抗CEA單克隆抗體及荷瘤裸鼠治療實驗研究[J]. 核技術，2002，11(25)：953-956.

Wu Weiyi, Fan Wo, Bao Junjie, et al.188Re labelling of the anti-CEA monoclonal antibody and its herapeutic study in nude mice bearing tumor[J]. Nuclear Technology. 2002，11(25)：953-956(in Chinese).

[4] 張智勇，王祥云，吳永慧.188Re直接標記單克隆抗體[J]. 核化學與放射化學，1998，3(20)：172-174.

Zhang Zhiyong, Wang Xiangyu, Wu Yonghui. Direct labeling of monoclonal antibody with188Re[J]. Journal of Nuclear and Radiochemistry，1998，3(20)：172-174(in Chinese).

[5] 章斌.188Re直接標記Octreotide的方法學[J]. 國外醫學·放射醫學核醫學分冊， 2002，26(5)：220-222.

Zhang Bin. Investigations of directly labelling octreotide with188Re[J]. Foreign Medical Sciences(Section of Radiation Medicine and Nuclear Medicine)，2002，26(5)：220-222(in Chinese).

[6] 許風華，周偉，胡偉青，等.188Re直接標記抗體方法研究[J]. 同位素， 2009，1(22)：18-22.

Xu Fenghua, Zhou Wei, Hu Weiqing, et al. Study of direct labeling antibody wth188Re[J]. Journal of Isotopes,2009，1(22)：18-22(in Chinese).

[7] 章斌，吳翼偉，范我，等.188Re直接標記牛血清白蛋白的方法學研究[J]. 中國航天醫藥雜志,2003，5(4)：23-25.

Zhang Bin, Wu Yiwei, Fan Wo, et al. Investigations of directly labeling BSA with Rhenium-188[J]. Medical Journal of CASE,2003，5(4)：23-25(in Chinese).

[8] 黃麗瓊，饒國輝.188Re 標記放射性藥物在腫瘤治療中的研究進展[J]. 中國熱帶醫學. 2009 ，9(9)：1 919-1 920.

Huang Liqiong, Rao Guohui. Application of rhenium-188 labeled radiopharmaceuticals for cancer treatment[J]. China Tropical Medicine,2009 ，9(9)：1 919-1 920(in Chinese).

[9] 李貴平，張輝.188Re標記單克隆抗體的應用研究進展[J]. 放射免疫學雜志,2003，16(2)：113-115.

[10] 許鳳華，尹端沚，汪勇先.188Re 標記生物分子研究進展[J]. 核技術,2008，12(38)：932-936.

Xu Fenghua, Yin Duanzhi, Wang Yongxian. Recent progresses in188Re labeling biomolecules [J]. Nuclear Technology,2008，12(38)：932-936(in Chinese).

[11] Dadachova E.，Mirzadeh S. The role of tin in the direct labeling of proteins with rhenium-188[J]. Technical Notes,1997：605-608.